MBR中厌氧氨氧化运行特性及微生态结构

路青, 华兆哲, 李秀芬, 葛富青, 堵国成, 陈坚

(1.江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122)

MBR中厌氧氨氧化运行特性及微生态结构

路青1, 华兆哲＊2, 李秀芬1, 葛富青1, 堵国成2, 陈坚2

(1.江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122)

研究了膜生物反应器(MBR)中厌氧氨氧化(Anammox)的运行特性与微生态结构变化。采用含氮模拟废水进行试验,最终获得粒径集中在0.2～1 mm的红褐色厌氧氨氧化颗粒污泥。运行结果显示,厌氧氨氧化菌能够承受的容积负荷达0.245 kgTN/(m3·d);总氮、NH4+-N和NO-2-N去除率分别达到80%、81%、91%。水力负荷冲击试验表明,当HRT从14 h下降到7.9 h时,NH4+-N、NO-2-N去除率相对稳定,分别保持在75%和85%左右,厌氧氨氧化仍然能够稳定进行。通过末端限制性酶切片断长度多态性(T-RFLP)试验发现,反应器运行完成后微生物呈多态性分布,优势菌突出,其中起Anammox作用的菌属主要为planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas,这为厌氧氨氧化运行过程中微生物群落结构变化提供理论依据。

膜生物反应器;厌氧氨氧化;颗粒污泥;微生物种群分布

厌氧氨氧化(Anaerobic ammonia oxidation, Anammox)是在厌氧或缺氧条件下,厌氧氨氧化微生物以N H4+-N为电子供体,NO2--N为电子受体,生成氮气的生物过程[1]。据报道,实验室规模处理模拟废水基质氮去除速率最高达26.0 kg/(m3·d)[2],生产性Anammox反应器处理污泥压滤液,基质氮去除速率最高达9.5 kg/(m3·d)[3]。

然而Anammox在实验室规模的反应器中启动往往要几个月甚至一年[4-10],在实际应用启动阶段则需要3年多[3]。主要是由于Anammox菌的生长速率低、细胞产率低、Anammox微生物由于大量气泡的产生易被出水洗出[4]。因此,必须寻求更为有效的反应系统或操作方式来避免生物量的流失[5-10]。

启动阶段获得高的生物保留量十分重要,因为即使是生物量微小的流失也会造成启动时间的延迟[11-13]。膜生物反应器(Membrane Bioreactor, MBR)是膜组件与生物反应器的有机结合,可将几乎全部的微生物保留在反应器中,较高的污泥浓度可使污染物去除率提高[14-15]。Wyffels[16]第一次成功把MBR运用到Canon(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)工艺中,接着Trigo C[17]接种驯化好的Anammox颗粒污泥,研究MBR的启动过程中发现,在MBR中没有出现NO2--N的积累、微生物以颗粒形式聚集生长。因此,MBR有利于增殖缓慢的微生物,如Anammox菌的截留生长。作者在MBR中接种普通厌氧颗粒污泥,研究反应器中Anammox的运行特性和微生物结构变化,旨在为建立Anammox快速启动的适宜条件提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 MBR反应器及运行条件

MBR反应器见图1。该装置由机玻璃制成,有效容积1 L,内径80 mm,高220 mm。U型中空纤维膜组件由杭州浙大凯华公司生产,孔径为0.1～0.2μm,材质为聚丙烯。

运行条件:p H为7.6±0.15,温度为(32±1)℃,水力停留时间为1 d。半连续运行,具体为进水1 h,循环22.5 h,静止0.2 h,出水0.3 h。

图1 MBR反应器装置图Fig.1 Sketch of membrane reactor for anammox enrichment

1.2 接种污泥及试验用水

反应器接种污泥来自无锡柠檬酸厂污水处理反应器的厌氧颗粒污泥,总固体质量浓度(TS)14.8 g/L,挥发性固体质量浓度(VS)9.6 g/L,VS/TS为0.65。试验用水为人工模拟废水,具体成分见表1。

表1 模拟废水组成[17]Tab.1 Composition of the synthetic media

1.3 分析测试方法

1.3.1 物理性质测定

1)污泥粒径:从反应器内取一定量污泥,用水冲洗后使之依次通过1.5、1、0.8、0.5、0.2 mm的分样,然后将各个分样筛截留的污泥收集,在105℃下烘干、称重,计算不同粒径范围的污泥所占比例(质量比)。

2)污泥体积指数(SVI)、TS、VS:质量法。

1.3.2 化学分析

1)Anammox污泥活性测定[18]:在250 mL摇瓶中加入一定量待测污泥样品,NH4+-N和NO-2-N质量浓度均为70 mg/L的模拟废水混合,用丁基橡胶塞密封,并用氮气置换摇瓶顶端空气2～3 min,避光置于30℃恒温水浴中。根据反应进行的程度,定时测定NH4+-N、NO3--N和NO-2-N的质量浓度。总氮(TN)=N H4+-N+NO-2-N-NO3--N。

2)氨氮:水杨酸-次氯酸盐光度法。

3)亚硝基氮:N-(1-萘基)-乙二胺光度法。

4)总氮:紫外分光光度法。

5)p H:DEL TA 320 p H计。

1.3.3 微生态结构分析

1)DNA提取、纯化:采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒法,TaKaRa纯化试剂盒法对DNA纯化。

2)PCR扩增和纯化:采用总细菌引物27F/ 1492R扩增体系(总体积50μL):10×PCR buffer 5μL,MgCl22 mmol/L,dNTPs 120μmol/L,正反引物各20μmol/L,模板1μL,Taq酶2.5μL,加超纯水至终体积为50μL。扩增条件:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,72℃退火1 min,30个循环, 72℃延伸7min,最后4℃保存。TaKaRa纯化试剂盒法对扩增产物纯化。

3)酶切:PCR纯化产物用MspI/HhaI2种酶分别进行消化,MspI酶切体系为(总体积为20 μL):10×Taq buffer 2.0μL,50～100 ng PCR产物,0.1%BSA 2μL,2.5μL酶,加超纯水至终体积20μL。混合液在37℃停留过夜,然后在65℃停留10 min,灭活,12℃保留,终止反应。

消化产物由上海基康生物公司进行检测,检测数据包含末端片断长度和峰面积,用威斯康星—麦迪逊大学建立的基于Web(http://trflp.limnology.wisc.edu/assignment.jsp)的T-RFLP数据分析方法进行分析处理[19]。

2 结果与讨论

2.1 MBR中厌氧氨氧化过程的物理特征

2.1.1 污泥质量浓度 图2显示的是MBR中污泥总固体质量浓度(TS)、挥发性固体质量浓度(VS)和VS/TS比值随时间的变化。在反应器运行过程的前期,污泥质量浓度会有所下降,后期则逐步上升;而VS/TS比值则随时间的增加而增加,由初始的0.66提高到0.77,表明体系中的生物量经历了一个减少到增加的过程。

图2 MBR中污泥质量浓度随时间的变化Fig.2 Time-courses of sludge concentration in the MBR

2.1.2 污泥颜色 接种的厌氧颗粒污泥为黑色,经过长时间驯化后变成红褐色,且随运行时间的延长红色逐渐加深。根据相关报道,Anammox菌含有丰富的细胞色素c[20],成熟的厌氧氨氧化污泥呈浅红色,污泥颜色越红,Anammox活性越高[18,21]。因此,从污泥颜色变化看,本实验中驯化后的微生物已具备了厌氧氨氧化菌的外观特征。

2.1.3 污泥粒径 反应器运行前后的污泥粒径分布分别见图3,4。可以发现,厌氧氨氧化运行完成后,MBR内颗粒污泥粒径主要集中在0.2～1.0 mm之间。为了确定颗粒污泥对反应器脱氮的贡献,测定了反应器中颗粒污泥的Anammox活性。经计算颗粒污泥的Anammox活性约为106 mg/ kgTN/(m3·d),据此推断颗粒污泥是MBR中Anammox功能的重要承载者。

图3 驯化前污泥粒径分布Fig.3 Diameter distribution of the inoculated sludge

图4 驯化后污泥粒径分布Fig.4 Diameter Distribution of the incubated sludge

2.2 MBR中厌氧氨氧化过程的化学特征

2.2.1 氮素的变化 Anammox反应器运行是Anammox菌的活化富集过程。由图5～7可以看出,Anammox反应器运行的0～10 d中,由于接种颗粒污泥中存在许多异养菌,而进水不含有机物,污泥中异养反硝化菌首先利用污泥中的有机物和NO-2-N进行反硝化,随后微生物由于自身消耗释放出NH4+-N,导致出水NH4+-N质量浓度高于进水,NO-2-N和NO3--N质量浓度基本为0。由于启动初期反应器内出现强烈的反硝化,出水NO2-N几乎为0。为了给Anammox微生物提供足够的电子受体,第12天,将进水NO-2-N质量浓度提高至98 mg/L。

图5 MBR中氨氮变化曲线Fig.5 Profiles of NH4+-Nremoval in the MBR

第28天,出水NO-2-N上升为21 mg/L,为了防止基质抑制作用,降低进水NO-2-N质量浓度。之后出水NO-2-N稳定。NH4+-N去除率有所升高,但是提高幅度不大且不稳定,在10%～30%间波动。随着Anammox菌的富集,NH4+-N和NO-2-N去除率进一步升高,出水NO3--N浓度逐步升高。Anammox菌从NO-2-N转化为NO3--N过程中获得还原力用于同化CO2,NO3--N的增长代表了微生物的增长。一般以N H4+-N和NO-2-N按一定比值(NH4+/NO-2-N:0.25～2)去除,标志Anammox反应的达成[22]。86 d时,去除的NH4+-N、NO-2-N和生成的NO3--N的比值为1∶1.14∶0.13,表明Anammox反应已经成为主导反应。

图6 MBR中亚硝基氮变化曲线Fig.6 Profiles of NO-2-Nremoval in the MBR

图7 MBR中总氮变化曲线Fig.7 Profiles of nitrogen removal in the MBR

第87天,逐步缩短HRT至14 h,经过23 d的运行,最终Anammox反应器的容积总氮负荷达0.245 kg/(m3·d),去除率为80%,出水NH4+-N和NO-2-N去除率分别为81%、91%。2.2.2 抗负荷冲击能力 保持进水N H4+-N、NO-2-N质量浓度分别为70 mg/L,以每两天增加10%进水量的方式,研究反应器的抗水力负荷能力,以进水量提升前后的基质去除速率的变化情况作为效能指标评价反应器运行的稳定性。由图8可知,当水力停留时间(HRT)由14 h缩短至7.9 h时,反应器表现出较好的抗冲击能力,MBR中NH4+-N、NO-2-N去除率分别是75%、85%,而继续缩短至5.4 h时,NH4+-N、NO-2-N去除率分别是50%、61%。说明当HRT缩短到一定程度时,进水中的N H4+-N、NO-2-N与Anammox菌接触时间过短,反应不能达到充分。试验期间NO-2-N和NH4+-N的去除量比值在1.1～1.3之间,表明在Anammox反应依然是主导反应,当HRT在7.9 h以上时,MBR具有良好的耐冲击能力。

2.2.3 p H值的变化 反应器运行过程中的p H值变化见图9。在运行初期,出水p H值远高于进水,最高达到了8.81,这是由于启动初期,微生物反硝化产碱所致。随着NO-2-N去除率的下降,反应器内微生物产碱作用减弱,p H值开始逐渐下降。由于Anammox过程是一个耗酸的过程[1],随着Anammox菌的富集,55 d后出水p H值开始升高,最终稳定在8.4左右。

图8 HRT对MBR中NH4+-N和NO-2-N去除率的影响Fig.8 Effects of HRT on ammonium and nitrite removals in the MBR

2.3 MBR中厌氧氨氧化过程的微生物种群特征

图10是用遗传分析仪AB13700扫描微生物16S rDNA PCP扩增产物的HhaⅠ和MspⅠ双酶切片段的图谱。酶切图谱上每一个末端限制性酶切片段(TRFs)至少代表一种类型的微生物,峰的面积反映出该种类的相对数量。从图中可以直接地反映出MBR启动前后污泥中微生物种类和相对数量的变化

作者对MBR系统中微生物的研究过程共100多天。在长时间的富集培养过程中,微生物种群变化十分明显。利用Sorenson′s法计算多样性指数(H′)。计算公式:H′=-∑(n/N)ln(n/N),式中n为每个波峰的面积,N为所有波峰的面积,算出富集前后微生物多样性指数分别2.0、2.5,说明污泥种群数量出现小幅度增加,污泥中细菌种群数量变化趋势与VS/TS变化及氮素去除情况相吻合。由图10可以看出,MBR启动后,污泥中优势菌群突出。反应器中优势菌群的种类、数量可能直接关系到反应器功能的强弱,因为即使在水力冲击(HRT由14 h缩短至7.9 h)的情况下,也有助于系统的稳定运行。根据生态学中的“多样性导致稳定性原理”,物种多样化具有稳定生态系统的功能特征[23]。因此,MBR中微生物菌群呈现多样性分布有利于稳定的厌氧氨氧化。MBR反应器运行前后微生物种群结构对比见图11。

图9 MBR中pH值变化曲线Fig.9 The changes of pH in the MBR

图10 16S rDNA PCR扩增产物两种酶切片段图谱Fig.10 The 16S rDNA PCRamplified production after enzyme digestion

图11 MBR反应器运行前后微生物种群结构对比Fig.11 Comprison of microbial communities between before and after Anammox process in the MBR

由图11可以看出,运行前后微生物类群发生了显著的变化。运行后系统中部分菌属如Clostridia,Flavobacteria等基本消失,出现planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等新的种属。每种类群的丰富度是其相对面积与总物种群落面积的比值。启动成功后污泥中Betaproteobacteria(从37%到44.5%)、Gammaproteobacteria(从6%到17.1%)出现了不同程度的增加,Chlorof lexi(10.7%到4.8%)、Actinobacteria(17.8%到4%)、Planctomycetacia(从0%到9.5%)得到富集,浮霉状菌的低生长率使其只有少量富集。迄今为止已确认的Anammox菌属都归于浮霉菌门。对于启动后出现的planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等菌属,相关文献已证明[24-25]其Anammox活性。而对于启动后出现的其他优势菌属是否具有Anammox活性,还需进一步研究。

3 结 语

1)经运行,在MBR中成功富集得到Anammox菌,容积总氮负荷达0.14 kg/(m3·d)。通过缩短HRT加快Anammox菌生长,当HRT缩短至14 h,容积总氮负荷达0.245 kg/(m3·d),总氮去除率约80%,出水NH4+-N和NO2--N去除率分别为81%、91%。水力冲击试验证明,MBR有良好的耐水力冲击能力,是一种较好的富集Anammox菌的装置。

2)在MBR中,普通厌氧颗粒污泥经过100多天驯化,变为粒径集中在0.2～1 mm的Anammox颗粒污泥。通过分批培养试验证明,颗粒污泥是MBR中起Anammox功能的重要承载者。

3)T-RFLP试验证明,微生物群落结构运行前后发生明显变化,运行后整个反应器中适应厌氧氨氧化运行方式的菌种增殖较多,包括planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等。

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(责任编辑:李春丽)

Operation Characterictics and Microbial Community Distribution of Anammox in a Membrane Bioreactor

LU Qing1, HUA Zhao-Zhe＊2, LI Xiu-Fen1, GE Fu-Qing1, DU Guo-Cheng1, CHEN Jian2
(1.School of Environmental&Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The operation characteristics and microbial community distribution of Anammox process in the MBR was studied in this manuscript.Seeding with synthetic media,we found that the granular sludge with 0.2～1 mm diameter was obtained successfully.The nitrogen-loading rate amounted to 0.245 kgTN/(m3·d),and the removal efficiency of total nitrogen,N H4+-N and NO2--N was 80%,81%and 91%,respectively.Experiencing the hydraulic shock text,the HRT of MBR was gradually shorted from 14 to 7.9 h,the NH4+-N and NO2--N removal efficiencies were kept at about 75%and 85%,respectively.Based on terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)analysis,Microbial community diversity was achieved, and the predominant populations ofAnammox bacteria found inMBRsystem were theplanctomyce,pirellula,gemmata,pseudomonas after enrichment.The results presented here provided a theoretical basis for the change of microbial community during Anammox process.

membrane bioreactor,anaerobic ammonia oxidation,granular sludge,microbial community distribution

X 703.1

:A

1673-1689(2010)04-0581-08

2009-04-15

国家973计划项目(2007CB 714036);江苏省自然科学基金项目(BK2007022);江苏省太湖水专项项目(BS2007125)。

＊通信作者:华兆哲(1969-),男,江苏无锡人,工学博士,教授,博士生导师,主要从事环境生物技术方面研究。Email:huazz@jiangnan.edu.cn。