抗性早熟合剂质量标准的研究

卢庆红,涂 琼

(江西省儿童医院药剂科,南昌330006)

抗性早熟合剂为医院验方,由淮山、茯苓、生地、知母、赤芍、玄参、夏枯草8味中药组成。经多年的临床实践证实,该药具有清热燥湿、利水补肾之功效,临床上主要用于儿童性早熟的治疗。为了有效控制该制剂的质量,采用薄层色谱(T LC)法对抗性早熟合剂方中夏枯草进行了定性鉴别,用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时测定了抗性早熟合剂方中所含芍药苷的含量。

1 主要试剂、试药与仪器

夏枯草对照药材、芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0773-9921),五氧化二磷(张家港东昌化工厂,批号:20031011)为化学纯,甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为重蒸馏水,抗性早熟合剂(江西省儿童医院制剂室自制,批号:050314、050418、050705)。硅胶 G 薄层板(江西省儿童医院临床药学室自制,规格:5 cm×20 cm),岛津10Avp高效液相色谱仪,CQ-250超声波清洗器(上海必能信超声有限公司),TG 3288 1/10 000电子分析天平(上海天平仪器厂),TGL-16GB小型通用离心机(上海安亭科学仪器厂),ZFC型三用紫外分析仪、WFH-203三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司),H.H.S21-4B电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)。

2 方法与结果

2.1 夏枯草的鉴别

1) 供试品溶液的制备:取抗性早熟合剂50 mL,加氯仿50 mL回流萃取1 h,重复2次,合并氯仿液,蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。

2) 对照药材溶液的制备:另取夏枯草对照药材粉末2.0 g,水煎液按供试品溶液的制备方法制成药材对照液。

3) 阴性对照溶液的制备:取缺夏枯草的样品,按供试品溶液的制备方法制成空白溶液。

4) TLC及结果:按T LC法(中国药典 2005年版一部附录ⅥB)实验[1],吸取上述3种溶液各10 μ L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-二氯甲烷-冰乙酸(10∶15∶1)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液[1],105℃加热约10 min。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同斑点,阴性样品无干扰。结果见图1。

图1 夏枯草的 TLC鉴别

2.2 芍药苷的RP-HPLC测定

1) 色谱条件:C18(150 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:乙腈-3%冰醋酸(15 ∶85);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:254 nm,柱温:30 ℃;理论塔板数＞1 500,分离度＞1.5。

2) 对照品溶液的制备:精密称取经60℃五氧化二磷真空减压干燥36 h的芍药苷对照品6.70、9.80 mg,分别置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,分别得浓度为(Ⅰ)670.0 μ g· mL-1、(Ⅱ)980.0 μ g·mL-1的对照品溶液,放置低温避光处保存,备用。

3) 供试品溶液的制备:量取抗性早熟合剂80 mL,置于蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加5%甲酸甲醇溶液溶解,过滤,滤液置于10 mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀,放置 24 h[2]。然后,超声提取30 min,放置至室温后再加5%甲酸甲醇溶液[1]补充减失的体积,摇匀,精密量取5 mL置于具塞玻璃离心管中,以 4 000 r·min-1离心 10 min,取上清液,用0.22 μ m微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。

4) 空白试验:按照上述色谱条件,精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液(阴性样品溶液的制备:按照本品的处方制法,制备缺少赤芍的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液)各20 μ L,分别用自动进样器注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果显示,供试品色谱中在于对照品色谱相应的位置上,有相同保留时间的色谱峰,而阴性样品在此保留时间无干扰。见图2。

图2 芍药苷、供试品、阴性样品色谱图

5) 标准曲线的绘制:按照浓度梯度,精密量取一定体积的芍药苷对照品溶液(Ⅱ),加甲醇稀释,摇匀,得浓度分别为 49.00、61.25、98.00、164.15、245.00、367.50 、490.00 μ g·mL-1的溶液,用0.22 μ m 微孔滤膜滤过,按上述色谱条件,分别吸取 20 μ L注入高效液相色谱仪,记录色谱峰,测定峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,得芍药苷的回归方程为Y=9.22X-44.03(r=0.999 8),结果表明,芍药苷检测浓度在 49.0～490.0 μ g·mL-1范围内,与峰面积积分值呈良好线性关系。

6) 精密度试验:精密吸取同一芍药对照品溶液,连续进样6次,其峰面积分别为1570.8、1 590.3、1 584.4、1 613.8、1 575.5、1 578.3,平均值为1 585.5,RSD=0.72%。

7) 稳定性试验:取抗性早熟合剂,照样品处理方法进行处理后,于常温下放置 0、1、2、3、6、12 h,测定芍药苷峰面积,RSD=0.93%。

8) 重现性试验:取同一批样品,按芍药苷供试品溶液制备方法制成6份供试品溶液,平行测定。结果:药苷的含量为34 μ g·mL-1,RSD=2.75%。

9) 加样回收率试验:分别精密量取同一批次且已测定芍药苷含量的抗性早熟合剂80 mL,共9份,分别精密加入670.0 μ g·mL-1的芍药苷对照品溶液 0.5、1.0、2.0 mL,充分混匀,按芍药苷供试品溶液测定方法进行测定,平均加样回收率为98.5%,RSD=2.24%。

10) 样品含量测定:取3批抗性早熟合剂各80 mL,分别按上述提取方法提取后,在色谱条件下进行测定,以外标法计算芍药苷含量,见表1。

表1 不同批次抗性早熟合剂中芍药苷含量的测定结果

3 讨论

抗性早熟合剂由多味中药组成,组分复杂。本实验采取较为简便、易行的TCL法,采取选用对照,药材随行对照,并采用阴性样品进行对比,斑点分离清晰,重现性好,方法无干扰。

在方法选择上,采用紫外分光光度法进行芍药苷含量测定[3],但专属性不强,对于复杂成分的制剂不适用。在流动相的选择上,于实验过程中,用不同的流动相:甲醇-1%冰醋酸(30∶70)、乙腈-1%冰醋酸(40∶60)、甲醇-2%冰醋酸(32∶68)、乙腈-3%冰醋酸(15∶85)进行实验,结果发现,以乙腈-3%冰醋酸(15∶85)最为合适。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:109.

[2]黄欣,苏乐群,韩玉东,等.反相高效液相色谱法测定少腹逐淤微粉颗粒中芍药苷的含量[J].中国药房,2005,16(6):457.

[3]白雁,李喜凤.活血逐瘀颗粒剂中芍药甙的含量测定[J].光谱学与光谱分析,1998,18(5):637-639.