肉桂挥发油GC-MS指纹图谱研究

金宏,于慧荣,公衍玲

(青岛科技大学化工学院,山东 青岛 266042)

肉桂为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的树皮,气味芳香。肉桂皮含有1%～4%挥发油,主要成分是肉桂醛(cinnamaldehyde)。肉桂具有补火助阳,引火归源,散寒止痛等功效,用于阳痿,宫冷,腰膝冷痛,肾虚作喘等[1]。现代药理研究表明肉桂酸和肉桂醛是肉桂中的两种活性成分,肉桂醛具有镇静,镇痛及解热作用;肉桂酸具有抗菌,升高白细胞,利胆,抗癌作用[2]。作者采用GC-MS法对大量肉桂挥发油样品进行分析时,发现肉桂挥发油图谱中各种成分出峰先后及其相对含量极具特征性[3-5],易于辨识。本工作利用GC-MS技术进一步建立肉桂挥发油的特征指纹图谱,作为肉桂药材的质量控制依据。

1 实验方法

1.1 试剂

10批次肉桂购于青岛同仁堂等药店,经鉴定均为肉桂药材,乙醚、无水硫酸钠等均为分析纯。

1.2 仪器

SFE-100m L超临界CO2萃取仪;

HP5890-HP5973GC-MS联用仪,色谱柱为SGE-30QC 3/AC 225(0.32 mm ×30 m,0.25μm)弹性石英毛细管柱。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品的制备

精密称取肉桂醛标准品5mg,于10m L的容量瓶中,加乙醚溶解、稀释至刻度,备用。

1.3.2 供试液配制

分别取10个批次肉桂各20g,按照超临界CO2流体萃取法提取肉桂挥发油[6]、分离纯化、稀释,在相同的色谱条件下进样分析。

1.3.3 色谱条件

程序升温为柱初始温度60℃,保持10min,以4℃/min升至 220℃,保持 25min;汽化室温度 250℃;检测器(FID)温度 250℃;柱压 60kPa。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS分析条件的考察

供试液配制:精取肉桂挥发油0.1m L,分别用乙醚稀释 10、50、100、200 倍,进样5μL 进行分析,结果显示以稀释100倍所得图谱的分离效果较为理想。

对照品的制备:精密称取肉桂醛标准品5mg,于10m L的容量瓶中,加乙醚稀释至刻度,备用。

升温程序的考察:取肉桂挥发油供试液,对升温程序进行考察。结果显示,柱初始温度为 60℃,保持10min,以4℃/min升至220℃,保持25min时各主要成分色谱峰的分离效果较好。

柱前压与流速的考察:在3种不同柱前压40、60、80 kPa的条件下进行考察,结果显示柱前压为60kPa时,各主要成分色谱峰的分离效果较好。

汽化室温度的考察:在3种不同汽化室温度230、250、270℃时分别用供试液进样分析,结果显示,6种主要成分在3种不同汽化室温度时相对含量几无差别,同时各主要成分色谱峰的分离效果较好,本实验确定以250℃为宜。

检测器(FID)温度的考察:在3种不同检测器温度230、250、270℃时分别用供试液进样分析,结果显示,6种主成分在3种不同检测器温度时相对含量几无差别,各主要成分色谱峰的分离效果较好,最后确定以250℃为宜。

2.2 方法学考察

色谱记录图考察:取肉桂挥发油供试液,在已经确定的色谱条件下进样分析3次,结果表明,15min开始出峰,75～120min时间段不再出峰,提示75min内挥发油成分出峰完全。因此选用15～75min时间段的记录图。

仪器精密度考察:在相同的色谱条件下连续进样5次,结果显示,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%,表明仪器精密度较好。

实验方法的重复性考察:取肉桂样品共5份,按相同的提取方法分别提取、分离纯化、稀释,制备出肉桂挥发油供试液5份,在相同的色谱条件下进样分析。结果显示,各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%,表明实验重复性较好。

待测样品的稳定性考察:取肉桂挥发油供试溶液,分别在0、1 、2 、4、6 、8、12、24 、48h 不同的时间点进样分析。结果显示,各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%,表明肉桂挥发油供试液稳定较好。

中药挥发油组分较多,几十以至上百种,而以为数不多的相对含量较大的主要特征性成分作为评价指标,考察色谱条件的精密度、稳定性、重现性是实际可行的选择。

2.3 样品检测

指纹图谱的建立:取肉桂20g采用超临界CO2流体萃取法进行提取、分离纯化、稀释,再分别对10个批次肉桂挥发油供试液在相同的色谱条件进样分析,其共有模式图谱见图1。其中有6个峰的峰面积比较大且较稳定,可以作为其共有峰。经过质谱计算机数据系统检索,确定了这6个组分,见表1。

表1 肉桂挥发油中化学成分分析及其相对百分含量

本研究结果与以往报道数据[2]基本相符,提示肉桂挥发油的主要成分稳定性强,具备指纹图谱阐述的可行性。

主成分与图谱特征分析:由10批次肉桂挥发油的色谱图可见,肉桂挥发油主要含有α-蒎烯(α-Pinene)、肉桂 醛 (Cinnamaldehyde)、α-石 竹 烯 (α-Caryophyllene)、桉油精(Eucalyptol)、α-松油醇(α-Terp ineol)、龙脑(Borneol)。

以上成分平均占有挥发油总量的90%以上,其出峰先后及其相对含量构成了肉桂挥发油的特征指纹图谱,见图1。

图1 肉桂挥发油的色谱图

肉桂挥发油色谱指纹图谱的最明显特点是6个强峰,和其它峰相比,表观丰度相差不大,故在选取共有峰时,这是一个主要特点。同时还应兼顾其它细小的指纹区域和考虑图谱的整体性,因此在建立指纹图谱时,供试品的浓度要适当,否则细小的峰会失去,将失去指纹图谱的意义。

肉桂挥发油特征指纹图谱的相似度计算:采用国家药品监督管理局推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”对测定结果进行计算,得到10个批次肉桂挥发性成分的共有指纹图谱的相似度见表2。

从表2结果可以看出,10批次肉桂挥发油样本的相似度都在0.9～1.0,未发现离群样本,符合国家药品监督管理局对中药指纹图谱相似度的要求。

表2 10批肉桂挥发油的相似度

2.4 讨论

采用本系统得到的肉桂药材的GC-MS指纹图谱分离度较好,其中肉桂挥发油的主成分α-蒎烯、肉桂醛、α-石竹烯、桉油精、α-松油醇、龙脑均可在图谱中完全展现出来。经对照品指认,指纹图谱中的2号峰为肉桂醛。

3 结论

肉桂挥发油指纹图谱分析条件:程序升温为柱初始温度60℃,保持10min,以4℃/min升至220℃,保持25min;汽化室温度250℃;检测器 (FID)温度250℃;柱压60kPa。肉桂挥发油指纹图谱的研究,使肉桂挥发油的研究从单一有效成分或指标成分的定性定量分析,转向有效成分群体分析,更加科学、准确地反映了肉桂的内在品质,因此,肉桂挥发油的指纹图谱的建立,可以作为肉桂药材鉴别和质量控制模式,同时也为肉桂中药制剂指纹图谱的制定奠定基础。

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:人民卫生出版社,2005:91.

[2]国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京:人民卫生出版社,1985:217-219.

[3]张桂芝,张石楠,孟庆华,等.GC-MS分析肉桂与桂皮挥发油的化学成分[J].药物分析杂志,2009,29(8):1256-1259.

[4]周雨,李向高.西洋参挥发油成分的GC/MS分析[J].分析化学,1997,25(24):412.

[5]魏刚,方永奇,刘东辉,等.GC-MS建立石菖蒲挥发油特征指纹图谱方法学研究[J].中国中药杂志,2004,29(8):764.

[6]杨云,张晶,陈玉婷,等.天然药物化学成分提取分离手册[M].北京:中国中医药出版社,2003,531-533.