醛固酮对3T3－L1前脂肪细胞与脂肪细胞内脂素表达和分泌的影响*

王 川，张少玲，严 励，程 桦

(中山大学附属第二医院内分泌科，广东 广州 510120)

不适当升高的醛固酮水平可引起心血管损害[1]。与同等血压的原发性高血压患者相比，原发性醛固酮增多症患者心血管损伤发生早、程度重，且这种现象不能单用醛固酮引起水钠潴留和血压升高等效应来解释[2]，因此还存在其它机制导致高醛固酮血症对机体的损害。醛固酮和脂肪细胞间存在交互作用:醛固酮可促进脂肪细胞的分化，而脂肪细胞分泌的某些因子可促进醛固酮的合成和分泌[3，4]。内脂素是脂肪细胞分泌的一种因子，它参与炎症、氧化应激和内皮损伤等多种生理病理反应[5]，而且2型糖尿病患者内脂素水平与醛固酮水平呈负相关[6]，这些研究提示醛固酮可能通过调节脂肪细胞内脂素的表达和分泌，参与高醛固酮血症对心血管的损伤。本实验体外培养3T3－L1前脂肪细胞和脂肪细胞，研究醛固酮对内脂素基因表达和蛋白分泌的影响及其可能机制。

材料和方法

1 细胞与试剂

3T3－L1前脂肪细胞(ATCC)、DMEM高糖培养基(Gibco)、醛固酮、安体舒通、3－异丁基－1－甲基黄嘌呤、油红 O(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，SYBR PrimeScriptTMRT－PCR试剂盒(TaKaRa)，PCR引物(宝生物工程有限公司设计并合成)，内脂素检测试剂盒(USCN＆LIFE)。

2 细胞培养和诱导分化

3T3－L1前脂肪细胞按1.5×105cells/cm2密度接种于6孔板，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、25 mmol/L DMEM高糖培养液进行培养。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，每2 d更换培养液1次，细胞接触抑制2 d后，换用含0.5 mmol/L 3－异丁基－1－甲基黄嘌呤、1.7 μmol/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松和10%FBS的高糖DMEM培养液培养2 d，再换用1.7 μmol/L胰岛素和10%FBS的高糖DMEM培养液培养2 d，以后用10%FBS的高糖DMEM培养液继续培养直到细胞分化为成熟脂肪细胞。每天在倒置显微镜下观察细胞生长分化情况，诱导后约6－8 d细胞分化成熟。此时可行油红O染色进行脂肪细胞鉴定。

3 实验分组

实验分为5组，分别为:(1)对照组(control):含25 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养;(2)低醛固酮组(low aldosterone，LA);(3)高醛固酮组(high aldosterone，HA):分别含10－8和10－6mol/L 醛固酮;(4)低醛固酮+安体舒通组(low aldosterone plus spironolactone，LA+SP);(5)高醛固酮+安体舒通组(high aldosterone plus spironolactone，HA+SP):分别含10－8和10－6mol/L醛固酮加10－6mol/L盐皮质激素受体拮抗剂－安体舒通。每组再分为2亚组:3T3－L1前脂肪细胞和脂肪细胞组，前脂肪细胞选择细胞融合80%左右的进行干预，脂肪细胞为成脂诱导第6 d的细胞，此时大约有80%的前脂肪细胞诱导分化成熟，每组分别处理24 h和48 h，重复3次。

4 实时RT－PCR检测内脂素和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)mRNA的水平

用Trizol分别提取每组总RNA，紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度。实时RT－PCR按SYBR PrimeScriptTMRT－PCR kit的操作说明进行，首先1 μg总RNA为模板，反应体积20 μL进行逆转录，反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。再以RT产物为模板，用SYBR green染料法进行实时PCR(ABI PRISM 7000实时PCR仪)扩增目的片段，测定内脂素和MR mRNA表达，18S作为内参照。引物序列如下:内脂素正向5'－TACTGTGGCGGGAATTGCTCTAA －3'，反向5'－CCACAGACACAGGCACTGATGA－3';MR正向5'－ CTTCAGTTCGTGCGGCTTCA －3'，反向 5'－AGAACCTCTGCCAACTCTGTCCA－3';18S正向5'－CAACACGGGAAACCTCACC－3'，反向 5'－CAGACAAATCGCTCCACCAA －3'，引物浓度 10 μmol，反应体积20 μL。PCR采用两步法，第一步95℃预变性10 s，第二步95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40 个循环，目标基因与18S mRNA进行比较，用ΔΔCt法计算相对量。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。

5 酶联免疫法检测内脂素水平

取细胞培养上清液100 μL，按试剂盒说明书测量内脂素的浓度。每孔均设3个复孔，用酶标仪在450 nm波长测量各孔吸光度值，根据样品的吸光度值由标准曲线得出相应的浓度(μg/L)。

6 统计学处理

结 果

1 细胞形态及内脂素基因表达和分泌变化

随着3T3－L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，细胞由梭型或不规则型逐渐变圆变大，胞内可见串珠状可被油红O染成鲜红的脂滴，见图1。

Figure1.3T3－L1 adipocytes stained with oil red O(×200).图1 油红O染色后的3T3－L1脂肪细胞

随着3T3－L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，内脂素mRNA的表达增加，诱导第6 d和第7 d较前脂肪细胞对照分别增加了4.3倍和7.3倍(P＜0.05)。

3T3－L1前脂肪细胞培养液中内脂素浓度低，无法测到，但脂肪细胞培养液中内脂素浓度随诱导时间延长明显增高，诱导第6 d和第7 d分别为(70.02±9.28)μg/L和(95.20±8.17)μg/L。

2 醛固酮对前脂肪细胞内脂素基因表达和蛋白分泌的影响

醛固酮作用前脂肪细胞24 h，LA和HA组内脂素mRNA的表达较同一时间对照组分别减少48.0%和52.0%，P＜0.05;作用48 h，分别减少49.4%和46.6%，P＜0.05，但与醛固酮浓度无关(LA vs HA，P＞0.05)。联用安体舒通48 h，LA+SP内脂素mRNA表达高于LA，P＜0.05，但仍低于对照组(P＜0.05)，见图2。无论有无联用安体舒通，醛固酮干预后，3T3－L1前脂肪细胞培养液中内脂素浓度仍未测到。

Figure2.The expression of visfatin mRNA in 3T3－L1 preadipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P ＜0.05 vs LA at the same time.图2 醛固酮作用24 h和48 h 3T3－L1前脂肪细胞内脂素mRNA表达变化

3 醛固酮对脂肪细胞内脂素基因表达和蛋白分泌的影响

醛固酮作用脂肪细胞24 h，LA和HA组内脂素mRNA的表达较对照组分别降低43.5%和51.2%，P＜0.05，培养液中脂联素浓度分别减少48.4%和47.1%，P＜0.05;作用48 h，内脂素mRNA的表达降低39.7%和48.6%，P＜0.05，脂联素浓度分别减少57.7%和56.1%，P＜0.05，以上变化均与醛固酮的浓度无关(LA vs HA，P ＞0.05)，见图3、4。

联用安体舒通，LA+SP的内脂素mRNA的表达以及培养液中蛋白浓度均高于LA(P＜0.05)，其中蛋白浓度仍然低于同一时间对照组(P＜0.05);HA+SP的内脂素mRNA的表达以及蛋白浓度低于同一时间对照组(P＜0.05)，但与HA比较差异无显著。

4 醛固酮对前脂肪细胞和脂肪细胞MR基因表达的影响

3T3－L1脂肪细胞MR基因表达较前脂肪细胞降低，诱导第6 d和第7 d分别降低30%和55%，P ＜0.05。

醛固酮作用前脂肪细胞48 h，LA的MR mRNA表达高于同一时间对照组(P＜0.05)，见图5;作用于脂肪细胞无论24 h还是48 h，LA和HA的MR mRNA表达均高于同一时间对照组(P＜0.05)，见图6。

Figure3.The expression of visfatin mRNA in 3T3－L1 adipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P＜0.05 vs LA at the same time.图3 醛固酮作用24 h和48 h脂肪细胞内脂素mRNA表达变化

Figure4.The visfatin concentration in 3T3－L1 adipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P＜0.05 vs LA at the same time;#P＜0.05 vs HA at the same time.图4 醛固酮作用24 h和48 h脂肪细胞内脂素浓度变化

Figure5.The expression of MR mRNA in 3T3－L1 preadipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time.图5 醛固酮作用24 h和48 h 3T3－L1前脂肪细胞MR mRNA表达变化

联用安体舒通，无论前脂肪细胞还是脂肪细胞，LA+SP和HA+SP的MR mRNA表达与对照组比差异无显著(P＞0.05)。

Figure6.The expression of MR mRNA in adipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P＜0.05 vs LA at the same time;#P ＜0.05 vs HA at the same time.图6 醛固酮作用24 h和48 h脂肪细胞MR mRNA表达变化

讨 论

本研究用10－8和10－6mol/L醛固酮干预3T3－L1脂肪细胞24 h和48 h，内脂素基因表达降低，同时培养液中的蛋白浓度下降，由此可见醛固酮可抑制脂肪细胞内脂素的基因表达和分泌。

醛固酮和脂肪细胞间存在交互作用:醛固酮可促进脂肪细胞的分化，而脂肪细胞分泌的某些因子可促进醛固酮的合成和分泌[3，4]。在超重的原发性高血压患者中体重指数与血醛固酮水平呈正比;体重减轻后，醛固酮水平下降[7]。此外，Wada 等[8]观察到醛固酮作用于3T3－L1脂肪细胞可抑制胰岛素诱导的葡萄糖摄取。结合本研究结果可见无论体内还是体外，醛固酮均可影响脂肪细胞的功能。

内脂素是一种由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，与炎症、氧化应激、血管内皮损伤和心肌纤维化等有着密切的联系。2型糖尿病患者醛固酮水平与内脂素水平呈负相关[6]，而安体舒通可增加糖尿病肾病患者内脂素水平[9]。细胞实验显示血管紧张素Ⅱ可抑制体外培养的人脂肪细胞内脂素mRNA表达，而血管紧张素转化酶抑制剂可增加内脂素mRNA表达[10]。因此我们推测醛固酮抑制脂肪细胞内脂素的基因表达和分泌，可能参与了其对心肾等脏器损害。

本实验还观察到醛固酮促进MR基因表达，而安体舒通可对抗醛固酮这种作用。醛固酮可与MR特异结合，醛固酮水平的变化能引起细胞内MR数量的改变，并且不同疾病状态和不同细胞MR变化趋势不一致。醛固酮可降低大鼠循环中单核细胞MR的数量，而对B和T淋巴细胞MR的数量无影响。在糖尿病患者中，低醛固酮水平伴随着单核细胞MR表达的上升;相反，在妊高征的患者中，低醛固酮血症却降低单核细胞MR的表达[11]。而本研究中醛固酮促进了脂肪细胞MR基因的表达。

MR是核受体家族的一员，近年来，MR的作用日益受到重视。MR不仅维持水钠平衡，还与心血管重构、行为认知以及脂肪分化等病理生理反应有关。细胞内MR数量的变化可引起功能的改变，在小鼠前脑选择性地敲除MR，会损伤小鼠的空间学习能力;相反，在前脑选择性地过表达MR，会导致小鼠应激后焦虑样行为的减少[12]。在小鼠心肌细胞上过度表达MR可引起离子通道重建，心室复极延长，导致严重室性心律失常[13]。激活MR可促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞[14]。此外，MR拮抗剂－安体舒通可增加肥胖糖尿病小鼠脂肪组织[15]和糖尿病肾病患者[9]内脂素水平。结合本研究结果:联用安体舒通，醛固酮对3T3－L1脂肪细胞内脂素基因表达和分泌的抑制作用减弱，提示MR与脂肪细胞的功能有着密切联系。

总之，本研究显示醛固酮可抑制3T3－L1脂肪细胞内酯素的基因表达和分泌，提示脂肪细胞及其分泌的内脂素可能参与了高醛固酮对机体的损伤，这为我们治疗高醛固酮血症带来的危害提供了一种新的思路，但体内情况如何尚需进一步研究。

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