蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞周期及凋亡的影响*

海广范，李生莹，崔泰震，白素平

(新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

蓝萼香茶菜[Isodon japonica(Burm.f.)var.glaucocalyx(Maxim)Hara]为唇形科香茶菜属植物，是毛叶香茶菜的变种，又名山苏子，广泛分布于我国北方。长期以来，我国民间作为毛叶香茶菜用，具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性[1]。蓝萼香茶菜还具有与剂量相关的心肌保护作用[2]。二萜类化合物是蓝萼香茶菜的主要化学成分，研究表明蓝萼香茶菜甲素具有保护肝脏、抗癌等作用[3]。蓝萼香茶菜乙素也属于二萜类化合物，本实验通过观察不同剂量蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞(人肺腺癌细胞)的抑制作用，探讨其对AGZY细胞周期和细胞凋亡的影响，进一步研究其抗肿瘤作用。

材料和方法

1 材料

1.1 AGZY细胞株 人肺腺癌细胞株(AGZY细胞株)由新乡医学院实验室冻存。AGZY细胞在含有体积分数10%新生小牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的RPMI－1640培养基中贴壁生长，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，2 d换液1次，培养瓶铺满时用2.5 g·L－1胰酶消化传代，细胞培养至对数期。

1.2 药品与试剂 新生牛血清(杭州四季青公司);RPMI－1640培养基(Gibco);胰酶(Gibco);蓝萼香茶菜乙素(新乡医学院药学院实验室提取)，经红外光谱、核磁共振、质谱确证其化学结构，利用高效液相色谱法(HPLC)测定其纯度为99.6%;MTT和碘化丙啶(广州威佳生物科技有限公司)。

1.3 仪器 超净工作台(江苏苏净集团有限公司);流式细胞仪(Beckman Coulter);倒置显微镜 XDS－200D(Nikon Co.);CO2培养箱(Thermo Forma Co.LTD);酶标仪(Thermo Multiskun Mk 3)。

2 方法

2.1 蓝萼香茶菜乙素的配置及分组 称取蓝萼香茶菜乙素3.74 mg，加入 50 μL DMSO 溶解，用 RPMI－1640培养液稀释，配置成终浓度为1 mmol/L原液(DMSO浓度为0.01%)，4℃冷藏保存。实验分为:对照组和用药组，对照组用含DMSO 0.01%的RPMI－1640培养液培养，用药组加入蓝萼香茶菜乙素，使其终浓度为 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，每组设置6 个复孔。

2.2 MTT法测定肿瘤细胞的存活率 取对数生长期细胞，细胞计数约1×107cells/L，接种于96孔板中，每孔液体100 μL，细胞贴壁后倾去原液，换成含0.5%血清的RPMI－1640培养液饥饿培养。24 h后更换培养液，加入蓝萼香茶菜乙素使其浓度为 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，继续培养24 h，每孔加15 μL MTT，4 h 后倾去所有液体，加115 μL DMSO溶解，37℃静置0.5 h，酶标仪570 nm检测，波长630 nm参考。计算AGZY细胞抑制率和IC50。抑制率=(1－测定组A值/正常对照组A值)×100%。

2.3 倒置显微镜下细胞形态学的观察 不同浓度蓝萼香茶菜乙素作用细胞24 h后倒置显微镜下(×400)拍照。

2.4 流式细胞仪分析蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞周期及凋亡的影响 获取对数生长期的人AGZY细胞，PBS洗2遍，0.25% 胰蛋白酶消化，用含10% 新生牛血清的RPMI－1640培养基制备成浓度为5×108cells/L的细胞悬液，于6孔板中每孔接种2 mL。将平板置于37℃、5%CO2培养箱，24 h后加入不同浓度的蓝萼香茶菜乙素，使其终浓度分别5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L;阴性对照组加相同体积的培养液。在给药后24 h，细胞用胰酶消化，离心收集细胞，细胞沉淀用70% 乙醇悬浮，在4℃冰箱固定过夜。固定后的细胞用PBS洗2遍并悬浮，加入PI染液，37℃避光温育30 min，在流式细胞仪上测定细胞各期DNA量，分析细胞周期并测定凋亡率(激发波长488 nm，发射波长630 nm)。

3 统计学处理

结 果

1 MTT实验结果

用MTT法检测蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的生长抑制作用，结果见表1。结果提示随着蓝萼香茶菜乙素剂量增加A值逐渐减小，抑制率逐渐增加，说明随着药物剂量的增加活细胞数量逐渐减少，对AGZY细胞的抑制作用逐渐增强。80 μmol/L剂量组对AGZY细胞的抑制作用最强。经统计学处理，蓝萼香茶菜乙素对 AGZY细胞的 IC50为0.11 mmol/L。

表1 蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的抑制作用Table1.The inhibitory effect of glaucocalyxin B on AGZY cells(.n=6)

表1 蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的抑制作用Table1.The inhibitory effect of glaucocalyxin B on AGZY cells(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group A value Inhibitory rate(%)Control 0.59 ±0.02 0.01 ±0.005 μmol/L glaucocalyxin B 0.54 ±0.11 7.92 ±0.17*10 μmol/L glaucocalyxin B 0.49 ±0.06 16.70 ±1.23＊＊20 μmol/L glaucocalyxin B 0.46 ±0.09 21.29 ±1.40＊＊40 μmol/L glaucocalyxin B 0.43 ±0.04*25.89 ±2.06＊＊80 μmol/L glaucocalyxin B 0.28 ±0.05＊＊ 49.51 ±2.47＊＊

2 倒置显微镜下不同浓度蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的影响

不同浓度蓝萼香茶菜乙素作用AGZY细胞24 h后，细胞形态学变化见图1。由图可见阴性对照组细胞贴壁生长，颗粒样凋亡细胞少见。随着蓝萼香茶菜乙素浓度的增加，细胞颗粒样改变数量明显增加，20 μmol/L剂量组和40 μmol/L剂量组颗粒样细胞清晰可见，数量显著增加，提示细胞凋亡数目增加。80 μmol/L剂量组细胞大量死亡，正常贴壁细胞少见。

Figure1.Effect of different concentrations of glaucocalyxin B on AGZY cells.A:control group;B:5 μmol/L glaucocalyxin B － treated AGZY cells for 24 h;C:10 μmol/L glaucocalyxin B － treated AGZY cells for 24 h;D:20 μmol/L glaucocalyxin B － treated AGZY cells for 24 h;E:40 μmol/L glaucocalyxin B －treated AGZY cells for 24 h;F:80 μmol/L glaucocalyxin B －treated AGZY cells for 24 h.图1 不同浓度蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的影响

3 蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞周期和凋亡率的影响

用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率，见表2。阴性对照组AGZY细胞分布于各个细胞周期。蓝萼香茶菜乙素各剂量组随着药物剂量的增加G2/M期细胞比例显著减少，呈现一定的剂量－效应关系。其中20 μmol/L剂量组、40 μmol/L剂量组和80 μmol/L剂量组与阴性对照组相比有显著差异。表明蓝萼香茶菜乙素具有抑制AGZY细胞向G2/M期移行的作用。AGZY细胞的凋亡率也随着蓝萼香茶菜乙素剂量的增加而增加，提示蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞凋亡的影响也呈现一定的剂量－效应关系。

表2 蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞周期和凋亡率的影响Table2.Effect of glaucocalyxin B on cell cycle and apoptotic rates of AGZY cells(.n=6)

表2 蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞周期和凋亡率的影响Table2.Effect of glaucocalyxin B on cell cycle and apoptotic rates of AGZY cells(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group G0/G1(%) S(%) G2/M(%)Apoptotic rate(%)Control 67.91 ±4.3619.27±1.58 13.01 ±1.49 1.19 ±0.025 μmol/L glaucocalyxin B 61.65 ±3.2926.43±1.21 11.05 ±1.32 7.23 ±1.05*10 μmol/L glaucocalyxin B 68.07 ±2.9623.77±2.09 8.45 ±1.20 9.76 ±1.62*20 μmol/L glaucocalyxin B 71.15 ±3.4720.94 ±3.65 7.95 ±1.36*16.58 ±2.01＊＊40 μmol/L glaucocalyxin B 76.32 ±4.0819.68±1.39 2.05 ±0.09＊＊29.75 ±3.40＊＊80 μmol/L glaucocalyxin B 79.87 ±1.2619.72±0.94 0.98 ±0.01＊＊41.39 ±2.17＊＊

讨 论

蓝萼香茶菜乙素是从蓝萼香茶菜中提取的二萜类化合物，其结构与蓝萼香茶菜甲素相似，是蓝萼香茶菜甲素的14－乙酰化物，把两者分别乙酰化，可以得到相同的乙酰化物。研究表明蓝萼香茶菜甲素具有保护心肌、改善微循环[4，5]等作用，但蓝萼香茶菜乙素的研究未见报道。本实验通过观察不同剂量蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的作用，研究其对人肺腺癌细胞凋亡的作用。细胞凋亡是细胞死亡的一种自然生理学过程，指在一定生理或者病理条件下细胞内特定基因操纵、调控的细胞死亡方式，因此也被称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)。细胞凋亡典型的形态学特征为:细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞膜结构完整，细胞膜内陷形成凋亡小体(apoptotic bodies)，形成颗粒样外观。多数植物性抗肿瘤药物对肿瘤细胞都具有一定的抑制生长、促进肿瘤细胞凋亡的作用，因此，细胞凋亡调控异常在恶性肿瘤的发展过程中具有非常重要的意义，肿瘤防治的关键是抑制细胞的增殖和/或促进细胞的凋亡[6，7]。

本实验MTT法检测结果提示蓝萼香茶菜乙素5 μmol/L剂量组、10 μmol/L 剂量组、20 μmol/L 剂量组、40 μmol/L 剂量组和80 μmol/L剂量组均能够不同程度抑制人肺腺癌细胞(AGZY细胞)的生长和增殖，且呈现一定得剂量－效应关系。其中以40 μmol/L剂量组和80 μmol/L剂量组抑制作用最为显著。蓝萼香茶菜乙素对AGZY细胞的IC50值为0.11 mmol/L。细胞形态学结果提示:不同浓度的蓝萼香茶菜乙素均可使AGZY细胞呈现颗粒样外观，表现为细胞凋亡特征，这种特征在20 μmol/L剂量组和40 μmol/L剂量组较为明显。流式细胞仪检测AGZY细胞周期和凋亡率结果也显示:蓝萼香茶菜乙素 20 μmol/L 剂量组、40 μmol/L 剂量组和 80 μmol/L剂量组可以抑制AGZY细胞向G2/M期的移行，抑制细胞的分裂和增殖;不同剂量的蓝萼香茶菜乙素均可导致AGZY细胞不同程度的凋亡，细胞凋亡率随着药物剂量的增加凋亡率也逐渐增加，呈现一定的剂量依赖性。鉴此可以初步判断蓝萼香茶菜乙素可以通过阻滞AGZY细胞向G2/M期的移行而发挥对其生长抑制和促使细胞凋亡的作用

综上所述，蓝萼香茶菜乙素对人肺腺癌细胞AGZY具有一定的抗肿瘤活性，可通过改变细胞周期来诱导肿瘤细胞的凋亡。有关蓝萼香茶菜乙素改变细胞周期诱导凋亡的具体作用机制，还有待进一步研究。

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