妊娠期高血压患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的变化及意义*

曹卫平， 钱秋菊， 温 坚， 陈 霁， 汪科换， 邵春梅

(1镇江市妇幼保健院，江苏镇江212001;2镇江市润州区人民医院，江苏镇江212000)

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，严重威胁母婴安全，是孕妇和围产儿发病和死亡主要原因之一。其发病率高达7%－10%，但确切原因和发病机制至今尚不十分清楚。现代生殖免疫学研究证明，正常妊娠的维持有赖于母胎免疫耐受的形成，一旦免疫耐受机制失衡，将导致病理性妊娠如流产、妊娠期高血压疾病等发生。近年来研究发现CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在外周免疫耐受、移植免疫耐受以及母体对胎儿的耐受方面起着重要作用［1］。转录因子Forkhead box p3、Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞发育和功能维持的重要调节基因［2］。本研究采用流式细胞术胞内染色和定量PCR的方法，分别从蛋白质和 mRNA水平检测Foxp3+的表达，以探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在妊娠期高血压疾病发病中作用。

材料和方法

1 材料

1．1 主要试剂 异硫氰酸酯(flioresceine isothiocyanate，FITC)荧光标记抗人CD4、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗人CD25以及藻红蛋白－青色素染料5(phycoerythrincyanine Dye5，PE－Cy5)标记的抗人Foxp3试剂盒(含配套的固定和透膜剂)均购自eBioscience;淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen);逆转录及定量PCR试剂盒(TaKaRa)。

1．2 研究对象及分组 选择2007年11月至2008年6月在镇江市妇幼保健院、镇江市润州区人民医院门诊及住院的56例妊娠期高血压疾病患者。其中妊娠期高血压疾病20例，轻度子痫前期16例、重度子痫前期20例。年龄平均为(30.2±4.8)岁，孕周平均为(35.6±3.2)周;选择同期正常孕妇20例，年龄平均为(31.4±5.2)岁，孕周平均为(37.2±1.4)周。正常育龄妇女16例，年龄平均为(29.2±5.8)岁。年龄比较差异无显著。2组孕妇孕周比较无显著差异。妊娠期高血压疾病的诊断参考乐杰主编的《妇产科学》(第6版)中的标准。

2 方法

2．1 标本采集 各组研究对象抽取静脉血4 mL，乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraucetie acid disodium salt，Na2EDTA)抗凝，采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，以PBS洗涤后重悬备用。

2．2 细胞表面及胞内染色以及检测 细胞染色的顺序是先进行细胞表面分子CD4及CD25的染色，然后经过固定、透膜后再染细胞内的Foxp3的分子。简要概括如下:取细胞悬液100μL，加20μL CD4FITC和CD25－PE混合抗体，避光4℃孵育30 min，冷PBS洗涤后再加入1 mL经过稀释的固定、透膜剂反应60 min后以透膜缓冲液洗涤并重悬，再加入20μL PE－Cy5标记的抗人Foxp3抗体(同时设同型对照反应管)，反应30 min后洗涤，以400μL冷PBS重悬，采用BDFACSCalibur流式细胞仪进行检测，应用CellQuest软件进行结果分析。

2．3 总RNA抽提及逆转录反应 采用Trizo1试剂提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA 2μg进行逆转录反应合成cDNA。

2．4 定量PCR检测Foxp3mRNA表达 取上述cDNA，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR反应，总体积为20μL，按试剂说明书操作。引物由上海生工合成，Foxp3:5’－TTTCTGTCAGTCCACTTCACCA －3’和 5’－CCAGCAGGTCTGAGGCTTTG－3’;β－actin:5’－TGGCACCCAGCACAATGAA－3’和 5’－TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3’。Foxp3的表达水平以其与内参照β－actin的比值表示，所用定量PCR仪型号为罗氏Lightcycler。

3 统计学处理

应用Stata 7.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(¯x±s)表示，组间均数比较采用t检验和方差分析。

结 果

1 流式细胞术检测妊娠期高血压疾病患者外周血CD4+CD25+T细胞比例改变

应用流式细胞术双标记技术检测妊娠期高血压疾病患者外周血CD4+T细胞CD25分子的表达，结果发现，与正常育龄妇女相比，正常妊娠妇女外周血中CD4+CD25+T细胞所占比例明显增加(P＜0.05)，妊娠期高血压患者呈下降趋势，但差异无显著(P＞0.05)，而子痫前期患者明显减少(P＜0.01);与正常妊娠妇女比较，妊娠期高血压组CD4+CD25+T细胞所占比例有减少的趋势，但差异无显著(P＞0.05)，子痫前期(包括轻度与重度)CD4+CD25+T细胞所占比例明显减少(P＜0.01)，而且重度子痫前期的比例明显低于妊娠高血压患者(P＜0.05)，见表1。

表1 流式细胞术检测妊娠期高血压疾病患者外周血CD4+CD25+T细胞Table 1．Detection of CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients with gestational hypertension by flow cytometry(%．¯x±s)

2 流式细胞术检测妊娠期高血压疾病患者外周血CD4+CD25+Foxp3比例变化

与正常育龄妇女相比，正常妊娠妇女外周血中CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞所占比例明显增加(P＜0.05)，而妊娠期高血压、轻度子痫前期和重度子痫前期患者CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞所占比例明显低于正常育龄(P＜0.05)和正常妊娠妇女(P＜0.01)。另外，轻度子痫前期和重度子痫前期患者CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞所占比例明显低于妊娠期高血压(P＜0.05)，见图1。

3 定量PCR检测妊娠期高血压疾病患者外周血Foxp3 mRNA表达

为进一步验证流式细胞术检测调节性T细胞的结果，采用定量PCR的方法检测了Foxp3 mRNA表达水平，所得结果与蛋白质表达水平相一致，见图2。

讨 论

近年来，一些具有免疫调节功能的T细胞(Treg)引起了研究者的广泛关注。胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)，约占人外周血CD4+T细胞的5% －10%，是最重要的Treg细胞亚群之一，其主要的功能有维持内环境稳定、抑制机体对同种异体移植物的排斥反应以及影响其它T细胞的功能等。CD4+CD25+Treg对人类妊娠有着重要的影响［1］。研究发现妊娠早期直至分娩后短暂时期，循环系统中Treg细胞显著增加。体外研究发现CD4+CD25+T细胞对母体自身有抑制效应。本研究发现，正常妊娠妇女外周血中CD4+CD25+T细胞所占比例明显增加，妊娠期高血压组CD4+CD25+T细胞所占比例有减少的趋势，但无显著差异，而子痫前期(包括轻度与重度)CD4+CD25+T细胞所占比例明显减少。Sasaki等［3］也报道子痫前期患者外周血中CD4+CD25+T细胞明显低于正常妊娠和正常育龄妇女，该结果与本研究结果相一致，提示这群调节性细胞可能参与了妊娠期高血压疾病发病。

Foxp3是一种转录因子，定位于细胞内，是CD4+CD25+T细胞分化发育和功能维持的一个重要调控基因。目前已证实Foxp3的mRNA及其编码蛋白Scurfin只特异性地表达于CD4+CD25+T细胞。虽然大部分CD4+CD25+T细胞产生于胸腺，但胸腺内Foxp3过度表达却不能阻止缺失功能性Foxp3基因小鼠疾病的发生，说明Foxp3在外周CD4+T细胞具有重要的功能。本研究发现Foxp3水平在各组间变化一致，即CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞在正常妊娠时显著增加，而妊娠期高血压疾病患者，随着疾病进展，CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞，逐渐下降，至重度子痫前期，下降尤为显著［4］，同时定量PCR检测结果也证明与蛋白质结果相一致，这些结果表明调节性T细胞可能参与了妊娠期高血压疾病的病理进程。外周血CD4+T细胞Foxp3表达降低，说明真正发挥抑制功能的调节性T细胞数量降低。而调节性T细胞的减少可能使妊娠期高血压疾病患者机体内负向调控机制发生紊乱，产生针对自身抗原成分的效应细胞及分子，打破了机体内环境稳定，从而引起母体免疫损伤，使胚胎易遭受免疫攻击而被母体排斥。

Figure 1．Flow cytometric analysis of the expression of the transcription factor Foxp3．A:the proportion of Foxp3．¯x±s．n=36(n=16 mild preeclampsia;n=20 severe preeclampsia)．*P＜0.05 vs normal pregnancy group;#P＜0.05 vs non－pregnancy group;◆P＜0.05 vs hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP)group．B:plots for Foxp3 vs CD25 expression of gated CD4+T cells，the Foxp3 positive cells were quantitated for the CD25+populations．PE:preeclampsia．图1 流式细胞术检测妊娠期高血压疾病患者CD4+CD25+Foxp3+比例变化

Figure 2．Analysis of Foxp3 expressing level in gestational hypertension patients of peripheral blood by using realtime PCR．¯x±s．n=36(n=16 mild preeclampsia;n=20 severe preeclampsia)．*P ＜ 0.05 vs normal pregnancy group;#P＜0.05 vs non－pregnancy group;◆P＜0.05 vs hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP)group．PE:preeclampsia．图2 定量PCR检测妊娠期高血压疾病患者外周血Foxp3mRNA表达

本研究从蛋白质和mRNA水平证明了CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞在妊娠期高血压疾病进程中表达异常，进一步深入研究CD4+CD25+Foxp3在妊娠期高血压疾病中作用，有望从蛋白质和mRNA水平找到新的干预靶点，从而通过使用主动免疫治疗为妊娠期高血压疾病的诊治提供新途径。

［1］ 陈莉娟，周 浩，朱剑文，等．Foxp3转染CD4+CD25－T细胞抑制 NK细胞活性［J］．中国病理生理杂志，2009，25(6):1151－1155．

［2］ Zheng Y，Rudensky AY．Foxp3 in control of regulatory T cell lineage［J］．Nat Immunol，2007，8(5):457 －462．

［3］ Sasaki Y，Darmochwakl－Kolarz D，Suzuki D，et al．Proportion of peripheral blood and decidual CD4+CD25+regulatory T cells in pre － eclampsis［J］．Clin Exp Immunol，2007，149(1):139－145．

［4］ Wilczvnski JR．Immunological analogy between allograft rejection，recurrent abortion and preeclampsia the same basic mechanism? ［J］．Hun Immunol，2006，67(7):492－511．