胺碘酮对低O2、酸中毒及肾上腺素条件下豚鼠左心室流出道自律细胞电活动的影响*

赵兰平，王雪芳，陈彦静，杜会博，胡兴光，季振慧

(1河北北方学院生理教研室，河北张家口075000;2河北师范大学校医院，河北石家庄050091)

胺碘酮对低O2、酸中毒及肾上腺素条件下豚鼠左心室流出道自律细胞电活动的影响*

赵兰平1△，王雪芳1，陈彦静1，杜会博1，胡兴光1，季振慧2

(1河北北方学院生理教研室，河北张家口075000;2河北师范大学校医院，河北石家庄050091)

目的:研究胺碘酮对豚鼠左心室流出道自律细胞电活动的影响以及胺碘酮对低O2、酸中毒和肾上腺素(EPI)所致该部位自律性改变的影响。方法:采用标准玻璃微电极细胞内电位记录技术，分别观测胺碘酮对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响，以及胺碘酮对无糖低氧、pH6.8和EPI导致的该电位改变的影响。结果:(1)0.1 μmol/L胺碘酮可使左心室流出道自发慢反应电位自发放电频率(RPF)减慢，最大舒张电位(MDP)绝对值减小，复极80%时间(APD80)延长(P＜0.05);1 μmol/L胺碘酮可引起4相自动除极速度(VDD)和0相最大除极速度(Vmax)减慢，动作电位幅度(APA)减小，复极50%时间(APD50)延长(P＜0.05)，RPF减慢，MDP减小和APD80延长(P＜0.01);10 μmol/L胺碘酮可使VDD进一步减慢，APA进一步减小(P＜0.01)，其它指标的改变维持1 μmol/L胺碘酮灌流时的水平。(2)低O2可使VDD、RPF和Vmax减慢，MDP和APA减小，APD50缩短(P＜0.05);和低O2组相比，1 μmol/L胺碘酮+低O2可使RPF和Vmax进一步减慢，MDP增大，APD80延长(P＜0.05)，VDD进一步减慢，APD50延长(P＜0.01)。(3)pH6.8的灌流液可使VDD和RPF减慢，APD80缩短(P＜0.05)，Vmax减慢，APA减小(P＜0.01);与pH6.8组相比，pH6.8的1 μmol/L胺碘酮可使RPF进一步减慢，MDP和APA进一步减小，APD80延长(P＜0.05)，VDD进一步减慢，APD50延长(P＜0.01)。(4)10 μmol/L EPI可使VDD、RPF和Vmax加快，MDP增大，APD50和APD80缩短(P＜0.05)，APA增大(P＜0.01);1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI可使VDD和RPF减慢，MDP和APA减小，Vmax减慢，APD50和APD80延长(P＜0.05，P＜0.01)。结论:胺碘酮可降低豚鼠左心室流出道的自律性，同时对低O2、酸中毒和EPI所致的该部位自律性改变有一定的影响。

胺碘酮;低氧;酸中毒;肾上腺素;左心室流出道;自发节律细胞

近年来的研究表明，临床上常见的室性期前收缩和特发性室性心动过速往往与右心室流出道的结构和功能异常有直接关系。我室在前期的研究中发现，由鱼及两栖类心脏上位于心室之后，具有独立兴奋和收缩功能的动脉球(bulbus cordis)部分演化而来的心室流出道组织，仍保留有动脉球阶段的一些电生理特性，如仍存在慢反应自律细胞和具有独立兴奋能力［1］。进一步的研究表明，流出道自律细胞与窦房结起搏细胞具有相似的特征和离子流基础［2，3］，而且其电活动可能受自主神经的调控［4］，故可推测源于流出道的心律失常可能为自主神经功能紊乱和体液中的儿茶酚胺(catecholamine，CA)分泌异常导致自律性异常所致。胺碘酮(amiodarone，Ⅲ类抗心律失常药物)在多项临床实验中被证明有良好的抗心律失常作用而成为治疗心律失常的主要药物之一。为了深入探讨心室流出道的电活动与心律失常的关系，本实验采用标准玻璃微电极细胞内记录技术，观测了胺碘酮对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响，在此基础上，记录并分析了胺碘酮对低O2、酸中毒和肾上腺素(epinephrine，EPI)所致该部位自律细胞电生理效应的影响，期望对深入探讨心室流出道的电生理特性提供实验依据。

材料和方法

1 标本制备

健康豚鼠，250－350 g，开胸取出心脏，并用O2饱和的改良Locke液(mmol/L:NaCl 157，KCl 5.6，CaCl22.1，NaHCO31.8，葡萄糖5.6，pH7.3－7.4)经冠脉进行灌注冲洗后，从主动脉瓣的左瓣与后瓣间向下剪开心室，保留各瓣膜完整，并以此为宽度，向下切取约4 mm的前庭组织制成标本。制好的标本用不锈钢针固定于灌流槽(1.5 cm×2 cm)内的硅橡胶上。用O2饱和的改良Locke液进行恒温(35℃±1℃)、恒速(10 mL/min)灌流，标本在灌流液中稳定30 min后开始实验。

2 电位引导

玻璃微电极充以饱和KCl电极液后直流电阻为10－20 ΜΩ。如能直接记录到自发电位，则不再进行刺激，若记录不到，则将刺激电极置于标本远离瓣膜一端的心肌组织上，给予波宽2 ms、1 Hz、2倍阈强度的方波刺激(YC－2型程控刺激器，成都仪器厂)，刺激时间由数秒至数分钟不等，直至诱发出稳定的自发节律，即停止电刺激开始实验。引导出的自发慢反应电位，经SWF－1B高阻抗微电极放大器放大，一路输入监听器监听，另一路采用RM6280多道生理信号采集处理系统，自动显示电信号，并分析自发慢反应电位的各项参数指标。

3 观测指标

4 相自动除极速度(velocity of diastolic depolarization，VDD)、自发放电频率(rate of pacemaker firing，RPF)、最大舒张电位(maximal diastolic potential，MDP)、0相最大除极速度(maximal rate of depolarization，Vmax)、动作电位幅度(amplitude of action potential，APA)、复极50%和80%时间(50%and 80%of duration of action potential，APD50and APD80)。

4 实验过程和分组

待自发节律稳定10 min后，开始采集正常的自发慢反应电位为对照组，然后改用含有一定浓度的药液灌流(为保证药效，各种药液均在实验前1 h内配制)。实时记录并分析自发慢反应电位的变化。实验分组如下:(1)0.1 μmol/L、1 μmol/L+10 μmol/L胺碘酮对左心室流出道自发慢反应电位的影响(n=8);(2)1 μmol/L胺碘酮对低O2电生理效应的影响(n=8);(3)1 μmol/L胺碘酮对酸中毒电生理效应的影响(n=8);(4)1 μmol/L胺碘酮对10 μmol/L EPI电生理效应的影响(n=8)。

5 统计学处理

数据以均数±标准差(¯x±s)表示，给药前后各项指标采用自身配对t检验。

结果

1 胺碘酮对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响

0.1 μmol/L胺碘酮灌流豚鼠左心室流出道标本10 min，MDP绝对值明显减小(P＜0.05)，APD80明显延长(P＜0.05)，RPF明显减慢，和正常对照组相比有显著差异(P＜0.05)，见表1、图1。

1 μmol/L胺碘酮灌流豚鼠左心室流出道标本10 min，3 min时MDP绝对值和APA开始减小，7 min时明显减小，并维持在此水平，与正常对照组相比有显著差异(MDP，P＜0.01;APA，P＜0.05);Vmax1 min时开始减慢，5 min时明显减慢(P＜0.05)，并维持相对稳定;APD50和APD80在给药1 min时开始延长，3 min时明显延长，和正常对照组相比，差异显著(APD50，P＜0.05;APD80，P＜0.01);VDD和RPF在给药当时即开始减慢，3 min时明显减慢(VDD，P＜0.05;RPF，P＜0.01)。在10 min的灌流过程中，RPF有时不稳定，可出现短暂的节律不齐现象，见表1、图1。

10 μmol/L胺碘酮灌流10 min，MDP绝对值和APA明显减小(P＜0.01)，Vmax明显减慢(P＜0.05)，APD50(P＜0.05)和APD80(P＜0.01)明显延长，VDD和RPF进一步减慢(P＜0.01)。10 μmol/L胺碘酮灌流过程中，节律不齐现象较频繁。冲洗30 min，VDD和RPF均不能恢复到给药前水平，说明胺碘酮的作用持续时间较长，见表1、图1。

表1 胺碘酮对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响Table 1.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract(¯x±s.n=8)

Figure 1.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract.图1 胺碘酮对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响

2 1μmol/L胺碘酮对低O2电生理效应的影响

用无糖低O2液灌流15 min，MDP绝对值、APA和Vmax显著降低(P＜0.05)，APD50显著缩短(P＜0.05)，APD80有缩短趋势，但无显著差异;VDD和RPF在无糖低O2液灌流1 min时开始有所加快，出现一过性节律增快现象，但随着灌流时间延长，VDD和RPF逐渐减慢，15 min时明显减慢，和正常对照组相比，有显著差异(P＜0.05)。在此基础上改用1 μmol/L胺碘酮+无糖低O2液灌流10 min，3 min时MDP绝对值开始增大，7 min时和无糖低O2液灌流组相比明显增大，并维持相对稳定(P＜0.05)，APA进一步降低，但和无糖低O2液灌流组相比无显著差异，Vmax明显减慢(P＜0.05)，APD50和APD80明显延长(APD50，P＜0.01;APD80，P＜0.05);VDD和RPF在1 μmol/L胺碘酮+无糖低O2液灌流1 min时进一步减慢，10 min时明显减慢，和无糖低O2液灌流组相比，有显著差异(VDD，P＜0.01;RPF，P＜0.05)。而且在1 μmol/L胺碘酮+无糖低O2液灌流过程中，自发节律较稳定，见表2、图2A。

3 1μmol/L胺碘酮对酸中毒电生理效应的影响

配制O2饱和的改良Locke液，调节pH为6.8，造成酸中毒的灌流液，此值是在心肌缺血、梗死的局部内环境中常见的。在10min的灌流过程中，MDP绝对值有增大趋势，但无显著差异;APA在灌流3 min开始减小，5 min时明显减小，和正常对照组相比，有显著差异(P＜0.05)，Vmax2 min时开始加快，5 min时明显加快(P＜0.01)，APD50有缩短趋势，但无显著差异，APD803 min时明显缩短(P＜0.05)，VDD和RPF在灌流1 min时有所加快，但无显著差异，5 min后即开始减慢，10 min时明显减慢，和正常对照组相比，有显著差异(P＜0.05)。在此基础上，改用pH 6.8的1 μmol/L胺碘酮灌流左心室流出道标本10 min，MDP绝对值、APA明显降低，和pH 6.8灌流组相比，有显著差异(P＜0.05);Vmax有减慢趋势，但无显著差异;APD50和APD80明显延长(APD50，P＜0.01;APD80，P＜0.05)，VDD和RPF在灌流1 min时进一步减慢，5min时明显减慢，和pH 6.8灌流组相比，有显著差异(VDD，P＜0.01;RPF，P＜0.05)，并在随后的灌流过程中，一直维持在此水平，见表2、图2B。

4 1μmol/L胺碘酮对10 μmol/L EPI电生理效应的影响

用10 μmol/L EPI灌流10 min，MDP绝对值(P＜0.05)和APA(P＜0.01)明显增大，Vmax加快(P＜0.01)，APD50和APD80明显缩短(P＜0.05)，VDD和RPF在给药30 s即开始增快，3 min时明显增快(P＜0.05)，并维持在此水平。用10 μmol/L EPI灌流10 min，此时自发慢反应电位各项指标已有明显改变且保持相对稳定，改用1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI灌流，APA和MDP绝对值在灌流5 min时开始降低，10 min时明显降低，和10 μmol/L EPI灌流组相比，有显著差异(P＜0.05);Vmax3 min时开始减慢，10 min时明显减慢(P＜0.05);APD50和APD801 min时开始延长，3 min时明显延长(APD50，P＜0.05;APD80，P＜0.01)，并维持相对稳定。VDD和RPF 3 min时开始减慢，10 min时明显减慢，和10 μmol/L EPI灌流组相比，有显著差异(P＜0.05)。在1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI灌流过程中，节律较稳定，见表2、图2C。

Figure 2.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract induced by hypoxia，acidosis and EPI.A:effects of amiodarone(1 μmol/L)on hypoxia;B:effects of amiodarone(1 μmol/L)on acidosis(pH6.8);C:effects of amiodarone(1 μmol/L)on EPI(10 μmol/L).图2 胺碘酮对低O2、酸中毒及EPI所致豚鼠左心室流出道自发慢反应电位改变的影响

表2 胺碘酮对低氧、酸中毒、EPI所致豚鼠左心室流出道自发慢反应电位改变的影响Table 2.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract induced by hypoxia，acidosis and EPI(¯x±s.n=8)

讨论

近年来众多的临床资料表明，一些过去一直无法解释和诊断的特发性室颤、早搏、心动过速等心律失常往往是由右心室流出道形态异常和功能障碍所致。本室以前的工作在国内外首次证明，在豚鼠、家兔、大鼠等左心室流出道部位仍存在慢反应自律细胞，且具有与窦房结起搏细胞相似的特征和离子流基础，即0期主要离子流为ICa－L，3期主要离子流为Ik，4期自动去极中，除Ik的进行性衰减外，还有ICa－L、ICa－T和If的参与［3］。而且其电活动可能受自主神经的调控，其中主要受心交感神经及体液中CA的调节［4］。说明自主神经功能紊乱或CA分泌异常在源于心室流出道心律失常的发生机制中也起一定作用。

广谱抗心律失常药胺碘酮是目前预防心房纤颤和维持窦性心律最有效且安全的药物。周琳等［5］的研究表明胺碘酮可明显抑制正常心肌细胞ICa－L，对正常及肥厚心肌细胞的Ik均有明显的抑制作用。周彤等［6］也证实胺碘酮可明显抑制ICa－L，且具有浓度依赖性。Yamashita等［7］的研究表明，胺碘酮对ICa－T也有一定的阻滞作用。本实验中用胺碘酮灌流左心室流出道标本，VDD和RPF减慢，Vmax减慢，APA减小，可能与胺碘酮的ICa－L和ICa－T阻滞有关。APD50和APD80的延长为胺碘酮阻滞Ik所致。MDP绝对值减小可能为Ik的阻滞导致Ik进行性衰减加速，最大复极电位尚未恢复到正常水平即发生了缓慢自动去极化。胺碘酮的效应表现为浓度依赖性，随着浓度的增加，各项指标的改变越明显。用胺碘酮灌流左心室流出道标本10 min，在随后的冲洗过程中，自发节律很难恢复到给药前水平，与文献报道一致［7］。

低氧和酸中毒对心肌细胞电生理特性的影响与多种离子流有关。自1983年Noma发现了IKATP以来，该通道在心肌缺血或低氧时的作用引起了电生理学者的极大关注。一般情况下，心肌细胞的KATP活性很低，只有在心肌缺氧，能量耗竭时才被大量激活。祝芬等［8］记录到低氧时外向电流峰值明显升高，该电流可被IKATP特异性阻断剂优降糖完全阻断，证明此电流是ATP敏感性钾电流。徐岩等［9］也证实急性低氧时，IKATP明显增加，同时伴有不同程度ICa－L抑制。Grover［10］报道，心肌缺氧时KATP被激活后，抑制电压依赖性钙通道。KATP通道还对细胞内外的酸碱度敏感。代谢产物(尤其是酸性代谢产物)堆积，pH下降可引起该通道的开放，促进K+外流［11］。同时抑制电压依赖性钙通道的激活，使Ca2+内流减少。本实验中用无糖低氧液和pH 6.8的灌流液灌流时，VDD和RPF减慢，APA减小，Vmax减慢，可能与ICa－L的抑制有关，APD50和APD80缩短与IKATP的开放密切相关。无糖低氧液灌流时MDP绝对值减小，原因可能为KATP开放导致细胞外K+积聚，阻碍K+进一步外流。胺碘酮可使低O2和酸中毒导致的VDD和RPF减慢进一步加重，可能为胺碘酮明显抑制Ik和ICa－L所致。黄冬等［12］的研究也证实胺碘酮对模拟缺氧状态下大鼠心室肌细胞的Ik1电流有明显的抑制作用。

体液中的儿茶酚胺可作用于心肌细胞膜上的β1肾上腺素能受体(β1－AR)，进而增加L型钙流(ICa－L)和4期内向电流(If)［13］。故本实验中用10 μmol/L EPI灌流时可表现为VDD和RPF明显加快，APA增大，Vmax加速，APD50和APD80缩短。MDP绝对值增大，可能是由于CA具有刺激生电性钠泵的作用之故［13］。而采用1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI灌流时，由EPI所致的各项指标的改变可逐渐恢复，说明胺碘酮可能具有对抗自主神经功能紊乱或体液中CA异常所致的源于心室流出道心律失常的作用。

［1］陈彦静，葛赋贵.豚鼠主动脉前庭组织的自律性研究和形态学观察［J］.生理学报，1994，46(5):458－464.

［2］邱丽颖，陈彦静，葛赋贵，等.豚鼠主动脉前庭自发性慢反应电位去极离子流的初步分析［J］.生理学报，2000，52(4):308－312.

［3］张晓云，陈彦静，葛赋贵，等.兔主动脉前庭自律细胞与窦房结电生理特性的比较［J］.生理学报，2003，55(4):405－410.

［4］赵兰平，张晓云，陈彦静，等.神经递质对豚鼠左心室流出道自律细胞电活动的影响［J］.生理学报，2005，57(5):593－598.

［5］周琳，蒋彬，李红霞，等.胺碘酮对大鼠肥厚心肌细胞急性电生理作用的研究［J］.中华心血管病杂志，2006，34(2):164－168.

［6］周彤，曾秋棠.阿魏酸钠与胺碘酮对家兔心室肌细胞L型钙通道电流的影响［J］.中国心脏起搏与心电生理杂志，2008，22(6):534－538.

［7］Yamashita N，Kaku T，Uchino T，et al.Short－and long－term amiodarone treatments regulate Cav3.2 low－voltage activated T－type Ca2+channel through distinct mechanisms［J］.Mol Pharmacol，2006，69(5):1684－1691.

［8］祝芬，马季骅，张培华.牛磺酸对低氧条件下豚鼠心室肌细胞动作电位和ATP敏感性钾电流的影响［J］.中国病理生理杂志，2005，21(1):92－95.

［9］徐岩，陈旭华，高世明，等.急性低氧对家兔心室肌钙、钾通道电流的影响［J］.心血管康复医学杂志，2004，13(4):317－319.

［10］Grover GJ.Protective effects of ATP sensitive potassium channel openers in model of myocardial ischemia［J］.Cardiovasc Res，1994，28(6):778－782.

［11］王文伟，龚惠，朱依纯，等.模拟缺血对心室肌细胞钙内流和钾外流的影响［J］.老年医学与保健，2003，9(2):84－86.

［12］黄冬，李京波，魏盟.胺碘酮对模拟缺氧状态下大鼠心室肌细胞瞬时外向和内向整流钾电流的影响［J］.中国心脏起搏与心电生理杂志，2007，21(4):345－349.

［13］姚泰.人体生理学［M］.第3版.北京:人民卫生出版社，2001.1148－1151.

Electrophysiological effects of amiodarone on pacemaker cells in guineapig left ventricular outflow tract under conditions of hypoxia，acidosis and treatment with epinephrine

ZHAO Lan－ping1，WANG Xue－fang1，CHEN Yan－jing1，DU Hui－bo1，HU Xingguang1，JI Zhen－hui2
(1Department of Physiology，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2The Hospital of Hebei Normal University，Shijiazhuang 050091，China.E－mail:zhaolp－doc@tom.com)

AIM:To study the electrophysiological effects of amiodarone on the pacemaker cells in guinea－pig left ventricular outflow tract under the conditions of hypoxia，acidosis and treatment with epinephrine.METHODS:The action potentials of the pacemaker cells in guinea－pig left ventricular outflow tract were recorded by conventional intracellular microelectrode technique.The effects of amiodarone on the spontaneous slow response potentials were investigated under the conditions of hypoxia，acidosis and treatment with epinephrine.RESULTS:(1)Amiodarone at concentration of 0.1 μmol/L markedly decreased the rate of pacemaker firing(RPF)and maximal diastolic potential(MDP)，lengthened 80%of the duration of action potential(APD80).Amiodarone at concentration of 1 μmol/L significantly decreased the velocity of diastolic depolarization(VDD)and RPF，the maximal rate of depolarization(Vmax)，MDP and amplitude of action potential(APA)，lengthened 50%of the duration of action potential(APD50)and APD80.Amiodarone at concentration of10 μmol/L led to a significant decrease in VDD and RPF，Vmax，MDP and APA，a notable lengthening in APD50and APD80was also observed.(2)Under the condition of hypoxia and perfusion with deprived glucose content for 15 min，VDD，RPF，MDP，Vmaxand APA decreased significantly，APD50was shortened notably.Under the condition of hypoxia，amiodarone at concentration of 1 μmol/L significantly decreased VDD，RPF and Vmax，increased MDP，lengthened APD50and APD80as compared to the cells treated with hypoxia only.(3)Perfusion with pH 6.8 solution for 10 min，VDD and RPF significantly decreased，Vmaxand APA notably reduced，APD80was markedly shortened.Under the condition of acidosis for 10 min，amiodarone significantly decreased VDD，RPF，MDP and APA，lengthened APD50and APD80as compared to the cells under the condition of acidosis only.(4)Perfusion of epinephrine at concentration of 10 μmol/L for 10 min resulted in a significant increase in VDD，RPF，Vmax，MDP and APA，a notable shorting in APD50and APD80was also observed.Compared to 10 μmol/L epinephrine group，1 μmol/L amiodarone+10 μmol/L epinephrine significantly reduced VDD，RPF，Vmax，MDP and APA，lengthened APD50and APD80.CONCLUSION:Amiodarone markedly decreases the autorhythmicity of the pacemaker cells in guinea－pig left ventricular outflow tract.This electrophysiological effects were significantly influenced by hypoxia，acidosis and epinephrine.

Amiodarone;Hypoxia;Acidosis;Epinephrine;Left ventricular outflow tract;Autorhythmic cell

Q463;R331.3

A

10.3969 /j.issn.1000－4718.2010.07.010

1000-4718(2010) 07-1295-06

2009－12－16

2010－04－22

河北省科技厅科学技术研究与发展计划资助项目(No.062761880)

△通讯作者Tel:0313－4029313;E－mail:zhaolp－doc@tom.com