测定直接胆红素方法的分析

唐礼新 邱春红

胆红素是血红素的代谢产物，主要在肝脏内经结合作用转化排泄，它在血清中以未结合胆红素（即游离胆红素）、结合胆红素（即单葡萄糖醛酸和双葡萄糖醛酸胆红素之和）及δ-胆红素（清蛋白共价连接胆红素） 3种形式存在。临床上测定血清胆红素是黄疸性疾病诊断与鉴别诊断的重要指标，对了解疾病的发展、转归有重要意义[1-3]。本文对Siemens Healthcare Diagnostics inc.生产的试剂盒进行评价和探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

Dimension RXL全自动生化分析仪。

1.2 试剂

试剂盒由Siemens Healthcare Diagnostics inc.生产；试剂Ⅰ成分：0.5%亚硝酸钠、0.5mol/L盐酸；试剂Ⅱ成分：0.45%对氨基苯磺酸、1.09%盐酸。

1.3 原理

重氮化对氨基苯磺酸是通过亚硝酸钠和对氨基苯磺酸在低pH的环境中结合而生成的。用0.05mol/L的HCL稀释样本。先记下空白读数以消除非胆红素色素的干扰。加入重氮化对氨基苯磺酸，结合的胆红素会转化成重氮基胆红素。

1.4 方法

主要分析参数设置测定方法：主波长540nm，副波长700nm，样品体积31μL，试剂体积R1为30μL，R2为60μL，读取终点ΔA。试验过程全部由Dimension RXL全自动生化分析仪完成。

2 结 果

2.1 精密度

按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）评价方案，取低、中、高3个不同浓度的DBIL样品上、下午双份测定，连续测20d，再每天测1次，共测20d，结果见表1。

表1 批内和批间精密度测定结果（μmol/L）

2.2 线性和回归分析[2]

按NCCLS的评价方案，选择低浓度（31.4μmol/L）和高浓度（360.0μmol/L）的混合血清2份，然后把这2份样品等量混匀产生中间值，再分别将中间值和低值、中间值和高值等量混匀，共产生5个不同值的样品。在Dimension RXL全自动分析仪上用本法从低值到高值，然后从高值到低值测定，求得均值为Y，以理论值为X进行回归分析，回归方程为：Y=0.9914X+0.075，r=0.9998。结果表明DBIL在350μmol/L内仍保持良好的相关性。

2.3 回收试验

取1份DBIL含量为6.4μmol/L的血清0.8mL，加入DBIL含量为56.3μmol/L的血清0.2mL，计算浓度。结果测定浓度为16.32和16.98μmol/L，回收率为104.10%。

2.4 干扰试验

2.4.1 血红蛋白干扰试验

取1份新鲜混合血清（DBIL为26.6μmol/L）分别加入不同浓度的血红蛋白，用本法测定DBIL。结果血红蛋白＜3.2g/L时，对测定结果无显著干扰，但当血红蛋白浓度≥5g/L时，测定值出现负数，表明血红蛋白浓度≥5g/L时，严重干扰DBIL的测定。

2.4.2 脂血干扰试验

取1份新鲜混合血清（DBIL为26.6μmol/L）分别加入不同浓度的脂肪乳，用本法测定DBIL。结果三酰甘油＜8mmol/L时对测定结果无显著干扰。

2.4.3 抗坏血酸干扰试验

取1份新鲜混合血清（DBIL为6.6μmol/L）分别加入不同浓度的抗坏血酸，用本法测定DBIL。结果抗坏血酸＜1.5g/L时对测定结果无显著干扰。

2.5 方法学比较

选择含量在5～350μmol/L的临床标本80份测定DBIL，按NC-CLS（EP9-P）的评价方案作方法学比较，结果见表2。

表2 两种方法测定DBIL的相关性比较

3 讨 论

目前如何准确可靠地测定血清胆红素是大家一致关注的问题，由于胆红素极易氧化，导致标准品制备困难，即使各厂家试剂配方相同，但由于校准液的问题，测定结果之间差异也较大。如果统一使用由Doumas等[4]提出的采用二牛磺酸胆红素作为DBIL测定的校准物，各种方法测定结果会得到很大改善，这与文献报道相一致[5]。本研究使用的测定试剂，经实验证明其稳定性好、抗干扰能力强，准确度和精密度良好，测定线性满足临床要求，值得推广应用。

[1]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:452.

[2]杨昌国,许叶,张抗.线性评价和干扰试验中NCCLS评价方案的应用[J].临床检验杂志,1999,17(3):184.

[3]韩志钧.临床化学常用项目自动分析法[M].沈阳:辽宁科学技术出版社,2005:1066.

[4]Doumas BT,Perry BW,Sasse EA,et al.Standardization in billirubin assays; Evaluations of selected methods and stability of bilirubin solutions[J].Clin Chem,1973,19(9):984-993.

[5]Young DS.Effects of Preanalytical Variables on Clinical Laboratory Tests[M].3rd ed. Washington,DC:AACC Press,2007:175.