噬菌体法快速检测痰中结核分枝杆菌的临床应用

李志媛*冯 爽 张 立 李晓珉

结核病细菌学检查是诊断肺结核及判定疗程的金标准,快速有效的细菌学检测是国内外研究的重点,也是结核病诊断的重要依据。利用噬菌体生物扩增法（Pha B assay）快速检测结核菌近年来在结核诊断研究中备受关注[1]。笔者采用Pha B法快速检测结核分枝杆菌标准株和肺结核患者的痰标本，均取得了理想结果，并与BACTEC-960法进行对比，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）分枝杆菌菌株：结核分枝杆菌标准株H37RV购自北京结核病研究所，在L－J罗氏培养基上生长3周后，用生理盐水洗下后研磨，采用麦氏比浊法比浊，稀释至1 g/L。（2）标本来源：40例痰标本取自我院2008年1月临床确诊为肺结核的住院患者深咳留取的合格痰标本。（3）试剂盒：FAST Plaque TBTM结核分枝杆菌快速诊断试剂盒购自上海金浩科技发展有限公司。BACTEC－960及其液体培养基购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体法 按照FAST Plaque TBTM试剂盒说明书配制所需试剂，包括痰处理液、培养基、琼脂、噬菌体、敏感细胞等。所有操作均在无菌条件下进行。（1）临床标本前处理：加等倍体积4%NaOH前处理液，涡旋震荡混匀，20 min后，加入15 mL C液（FPTB增强培养基）。充分混匀，10 000 r/min，离心20 min弃去上清液。沉淀物加1 mL C液混匀，转移0．5 mL至无菌反应管中备用。（2）噬菌体浸染：取0.5 mL处理后的标本加入反应管中，加入0．1 mL噬菌体溶液充分混匀，使反应管的内壁完全湿润，以保证杀毒剂与噬菌体充分接触，37℃孵育1 h。设置的阴性对照为反应管中不加标本，阳性对照为反应管中加入106稀释的敏感细胞。（3）中止浸染：加入0．1 mL杀毒剂，充分混匀，室温放置5 min后加入5 mL培养液和1 mL指示细胞。（4）浇注平皿与培养：上述混合培养液与5 mL溶解琼脂液快速混匀后倒入无菌平皿中，待凝固成形，置于37℃培养18～24 h。（5）结果观察：对于FAST Plaque TBTM质控检测结果，阳性及阴性对照应该在如下范围，阳性对照≥20个噬菌斑，阴性对照≤10个噬菌斑。对于FAST Plaque TBTM标本检测，结果应该在如下范围，阳性结果≥20个噬菌斑，阴性结果≤19个噬菌斑。

1.2.2 BACTEC-960法检测 按仪器与试剂说明操作。

1.3 统计学方法 计数资料行χ2检验。

2 结果

2.1 标准菌株 标准菌株H37Rv结核分枝杆菌应用Pha B法检测为阳性,在培养皿中可见到密布的噬菌斑。

2.2 2种方法检测结果比较 对40份肺结核患者的痰标本应用Pha B法和BACTEC-960法进行检测，结果见表1。2种方法检测肺结核患者痰标本的阳性率相近，差异无统计学意义（χ2＝0．67，P＞0．05）。Pha B法与BACTEC－960法的阳性符合率为84%（21/25），阴性符合率为86．7%（13/15），总符合率为85%（34/40）。

表1 Pha B法与BACTEC-960法检测结果比较

3 讨论

结核病细菌学快速检查历来是国内外学者关注的热点。Wilson等在1997年开发了一种新的方法,利用裂解性噬菌体裂解分枝杆菌的特性来判断结核杆菌的有无,此法即为Pha B，基本原理是分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活，已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖，并将菌体裂解，释放出子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞，并将其裂解，在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无及其数量多少，即可判断待检标本中是否存在活的结核分枝杆菌（MTB）或其他少数几种非结核分枝杆菌（NTM）。

Albert等[2]曾在对噬菌体法研究中发现以L-J培养为标准,噬菌体法的灵敏度为70．3%，特异度为99．0%，阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为92%和95%；对涂阴组的694份标本检测的灵敏度为48．8%，特异度为99．2%。庞茂银等[3]在噬菌体法与Bactect-460培养的比较研究中发现两者阳性率无差异，两者的阳性符合率为82．9%，阴性符合率为73．7%，总符合率为80%。这些研究表明噬菌体法与L-J和Bactect-460培养法有很好的相关性，灵敏度和特异度均比涂片法要高。本文的研究结果与上述文献报道的结论基本相近。笔者体会，噬菌体裂解法快速、简便，可以确定标本中有无活的结核分枝杆菌，但在实际检测中存在诸多影响因素，因而检测结果并非绝对准确，可作为结核病的初筛实验。

[1]吕斌,徐顺清,陈志飞，等.用重组噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性[J].中华检验医学杂志,2000,23(5):144-147.

[2]Albert H,Heydenrych N,Brookes R,et al.Performance of a rapid phage-basedtest,FastplaqueTB,todiagnosepulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Africa[J].Int J Tuberc Lung Dis,2002,6(6):529-537.

[3]庞茂银,胡忠义,王奕峰,等.噬菌体裂解法与BACTECT460法在结核分枝杆菌快速检测中的比较[J].中华传染病杂志,2003,21(1):27-29.