丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后促凋亡蛋白表达的影响1)

董 莎,刘瑞珍,李晓东

脑缺血再灌注损伤是多数缺血性脑血管疾病的主要病理生理过程[1],近年研究发现,缺血性脑损伤引起的神经元凋亡主要是由线粒体途径介导的,在凋亡诱导因素作用下,线粒体可释放促凋亡(Smac),其可进一步激活caspases程序 ,诱导细胞凋亡,Smac蛋白的发现完善并补充了线粒体为细胞凋亡调控中心的理论[2,3]。丁苯酞是我国第一个拥有自主知识产权的化学药物,其多种抗缺血机制受到广泛重视。本实验采用不同方法观察丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注后Smac蛋白表达的影响,旨在探讨其抗神经元凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康雄性Wistar大鼠180只,体重200 g～250 g,山西医科大学生理教研室动物中心提供,随机分为假手术组、缺血再灌注组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防组、丁苯酞预防加治疗组,每组36只,各实验组又分为缺血再灌注6 h、12 h、24 h 3个亚组。

1.2 主要试剂及仪器 丁苯酞胶囊:石药集团恩必普药业有限公司,批号:国药准字08100111,用 tween 80溶液稀释,给药计量为80 mg/kg;兔抗大鼠Smac多克隆抗体,Smac(H-177):北京中杉生物技术有限公司;细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL):北京中杉生物技术有限公司;BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)由山西医科大学生理教研室提供。

1.3 动物模型制备及给药 动物模型制备参照Zea Longa法加以改良制作,假手术组鱼线置入颈内动脉10 mm即可,余步骤同模型组。各组均在术后1 h～2 h大鼠清醒时行神经功能评分,其标准参照Berderson 5分制法进行,1分～3分判定为造模成功,0分、4分或死亡剔除,再随机补充。造模成功的大鼠分别于再灌注6 h、12 h、24 h后麻醉,断头取脑,去除脑干和小脑,于固定液中固定24 h,常规脱水,石蜡包埋待用。

给药,假手术组及缺血再灌注组采用缺血1 h后腹腔注射同体积生理盐水;丁苯酞治疗组于缺血1 h后腹腔注射丁苯酞稀释液;预防组采用手术前一周连续灌胃给药,每日2次,手术当天不给药;预防加治疗组采用术前一周连续灌胃给药,缺血1 h后腹腔注射给药1次。

1.4 免疫组化测Smac蛋白 取厚约 3 μ m的冠状切片,常规脱蜡脱水,经H2O2及蒸馏水浸泡后PBS洗涤,滴加一抗100 μ L,4℃冰箱过夜,次日取出室温放置30 min后PBS洗涤,滴加二 抗100μ L,37℃烤箱置20min后洗涤 ,DAB显色 。采用BI-2000医学图像分析系统,测量Smac蛋白染色阳性细胞的平均灰度值。

1.5 TUNEL法测凋亡细胞 将凋亡检测试剂盒中试剂1与2配成T UNEL反应混合物,计数T UNEL阳性细胞数。

1.6 Western检测蛋白水平 取组织100 mg,加入蛋白裂解液1 mL(RIPA裂解缓冲液),匀浆,离心后取上清加入等体积的2×SDS buffer,煮沸5min,迅速冰浴,离心后取上清备用,SDSPAGE电泳,转膜,封闭,一抗孵育:大鼠来源 Smac和beta-actin用TBST以1∶1 000稀释,4℃过夜;二抗孵育:二抗以 1∶1 000稀释,室温孵育 2 h;ECL底物化学发光显色,扫描,进行图像分析。

1.7 统计学处理 SPSS 11.0软件进行单因素方差分析,实验结果用均数±标准差(±s)表示,检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 HE染色观察病理改变 假手术组脑组织形态结构基本正常,细胞密度大,缺血再灌注组缺血侧脑组织结构较疏松,间质水肿,有散在空腔形成,且出现不同程度的神经元变性、坏死,神经细胞数目明显减少,胞核形态不规则,轮廓模糊。治疗组、预防加治疗组脑组织形态结构大致正常,病理改变轻微,海马区可见锥体细胞。

2.2 免疫组化结果 假手术组中Smac蛋白呈弱阳性表达,缺血再灌注组于再灌注6 h后Smac蛋白已经开始表达,再灌注24 h表达量最高,阳性细胞于胞浆胞核都着色,染色呈棕黄色颗粒,广泛表达于大脑皮层和海马。丁苯酞治疗组、预防加治疗组各时间点Smac蛋白表达较缺血再灌注组弱。详见表1。

表1 大鼠脑缺血再灌注后Smac蛋白表达图像分析的灰度值(±s)

表1 大鼠脑缺血再灌注后Smac蛋白表达图像分析的灰度值(±s)

组别 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手术组 12 179.96±2.051) 179.81±2.681) 179.85±2.511)模型组 12 153.05±1.10 143.57±1.92 139.60±2.20治疗组 12 169.08±1.681) 167.69±1.671) 157.02±2.001)预防组 12 153.98±2.11 144.01±2.95 139.73±3.12预防加治疗组 12 175.74±2.361)2) 175.46±1.471)2) 166.27±2.001)2)与模型组同时间点比较,1)P＜0.05;与治疗组同时间点比较,2)P＜0.05

2.3 TUNEL检测结果 假手术组凋亡细胞偶可见;缺血再灌注组各时间点在大脑皮层和海马区凋亡细胞表达较多,表现为细胞核固缩,内散在棕黄色颗粒。其中以缺血再灌注24 h凋亡细胞表达最多;丁苯酞治疗组、预防加治疗组凋亡细胞数较少。详见表2。

表2 大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡数(±s)个/400倍视野

表2 大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡数(±s)个/400倍视野

组别 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手术组 12 3.08±1.001) 3.67±0.991) 4.50±1.781)模型组 12 26.58±2.64 27.00±2.89 27.33±3.73治疗组 12 17.17±2.731) 17.33±2.311) 17.33±2.841)预防组 12 24.00±1.60 26.67±2.35 26.67±3.26预防加治疗组 12 13.58±1.931)2) 13.58±1.981)2) 14.00±2.801)2)与模型组同时间点比较,1)P＜0.05;与治疗组同时间点比较,2)P＜0.05

2.4 Western blot检测结果 以 Smac蛋白/β-actin作为比较指标,提示假手术组中仅有少量Smac蛋白,缺血再灌注组Smac蛋白含量显著增多,其与β-actin的比值大于1,治疗组与预防加治疗组中的Smac蛋白含量较缺血再灌注组明显减少。详见表3。

表3 Western bolt检测Smac蛋白/β-actin结果(±s)

表3 Western bolt检测Smac蛋白/β-actin结果(±s)

组别 n 再灌注后24 h假手术组 36 0.825±0.0151)模型组 36 1.218±0.018治疗组 36 0.964±0.0231)预防组 36 1.212±0.027预防加治疗组 36 0.931±0.0121)2)与模型组比较,1)P＜0.05;与治疗组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

近来研究表明在缺血缺氧所致的神经元凋亡机制中,线粒体通路起主导作用,凋亡刺激引起线粒体膜通透性变化,可诱导其释放一种促凋亡蛋白-Smac[4,5]。XIAP是IAPs蛋白酶家族中普遍存在的内源性凋亡蛋白抑制剂,其抑制Caspases活性作用能被多种基因负性调控,Smac是其中之一,因其可直接与IAP结合,故又命名为低等电点的IAP直接结合蛋白。正常情况下Smac位于线粒体内膜腔,当线粒体受到凋亡信号刺激膜孔开放即移位到胞浆与XIAP的BIR3结构域竞争性结合解除其对Caspase-9的抑制,与XIAP的BIR2结构域竞争性结合则解除其对Caspase-3的抑制[6],而且Smac还可通过与胞质内的Apaf-1形成凋亡复合体、与效应Caspases相互作用等多种途径增加细胞对凋亡信号的敏感性,这均是Smac蛋白促进神经细胞凋亡造成继发性脑损伤的原因。

丁苯酞与南方水芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素的结构相似,动物药效学研究提示,其可阻断缺血性脑卒中所致脑损伤的多个环节,具有较强的抗缺血作用,可明显缩小大鼠局部脑缺血的梗死面积,减轻脑水肿,改善脑能量代谢和缺血区的微循环和血流量。

本实验研究了Smac蛋白在脑缺血再灌注损伤后的表达及丁苯酞对其的影响,观察到脑缺血再灌注损伤6 h后胞浆中Smac蛋白的免疫阳性细胞增多,24 h表达最多,并且胞浆和胞核都着色[7],提示Smac蛋白可能参与了脑缺血损伤的病理过程。丁苯酞治疗组、预防加治疗组各时间点Smac蛋白的表达均较缺血再灌注组低,提示丁苯酞可能通过下调Smac蛋白的表达发挥保护神经细胞的作用。丁苯酞提前预防组阳性细胞的表达同模型组比较尚不能认为有统计学意义,而丁苯酞预防加治疗组中阳性细胞的表达却明显低于治疗组,因此丁苯酞预防脑缺血再灌注损伤的作用机制尚待研究。

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