血浆E-选择素及基因S128R多态性与山西汉族脑梗死患者的关系

王 芳,刘荣臻,刘志伟

脑梗死(infarction cerebral,CI)是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的常见疾病,近年来呈年轻化趋势,其高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率严重危害中老年人的健康。E-选择素(E-selectin)作为重要的炎症细胞因子,它与高血压,血脂代谢异常、动脉粥样硬化的形成等脑梗死高危因素之间关系密切。本研究通过检测山西汉族脑梗死患者血浆E-selectin水平及基因S128R多态性,探讨其与脑梗死之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 病例组脑梗死患者来自2008年11月—2009年2月山西省汾阳医院神经内科门诊、住院患者73例,男40例,女33例,年龄(60.11±11.48)岁。诊断符合全国第四届脑血管会议诊断标准[1],均经头颅CT或M RI确诊,排除冠心病、感染性疾病、糖尿病、肝肾功能衰竭等引起的患者,同时剔除近期服用降脂、激素药物的患者;合并高血压35例,高脂血症23例,无并发症15例。

对照组85名,男49名,女 36名,年龄(60.74±10.05)岁,为同期来本院进行健康体检者,无脑梗死、脑出血、糖尿病、高血压、高血脂、肝、肾等自身免疫性疾病病史。全部试验对象均长期居住于山西省、无血缘关系。

1.2 研究方法

1.2.1 标本的收集 病例组于发病24 h内抽取清晨空腹静脉血4 mL,3 000 r/min离心5 min,分离血浆和血细胞,-80℃低温冰箱保存;对照组做同样处理。

1.2.2 试验方法 ELISA法测定各组血浆E-选择素水平,血液基因组DNA提取试剂离心柱型(天根生物技术公司)抽提DNA,PCR-RFPL法进行DNA多态性分析。

1.2.2.1 引物设计与合成 参考有关文献设计一对引物[2],上游引物:5'-AGTAA TAGTCCTCCTCATCATG-3',下游引物:5'-ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG-3'以特异性扩增包含S128R位点的序列。

1.2.2.2 PCR 扩增 PCR 扩增 体系 25 μ L,模 板DNA 5 μ L,上下游引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)各20 pmoL,2×Pfu PCR MasterMix 12.5 μ L(北京天根生物技术公司)。用热循环仪94℃预变性5 min,94℃变性30 s,59℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环35次,最后72℃延伸 5 min。

1.2.2.3 限制性核酸内切酶酶切 PCR扩增产物10 μ L,PstⅠ(M BI Fermentas)10 U,10×Buffer 2 μ L,双蒸水 18 μ L。 37℃温育箱孵育10 h。

1.2.2.4 电泳判断基因型及测序 酶切产物加样在含EB、浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳,电压145V电泳50 min,紫外灯下拍照,经凝胶成像与分析系统(JD801系列,中国江苏)观察电泳图。对各基因型抽样测序(北京天根生物技术公司)。

1.2.3 血浆E-选择素含量测定 所有标本用E-selectin ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)检测,试验步骤严格按照试剂盒说明操作。酶标仪(BIO-RAD MODEL680,USA)490 nm处测OD值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件包分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算,单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表χ2检验,并以比值比(OR)及其95%可信区间(CI)表示相对风险度。血浆E-选择素水平用均数±标准差(±s)表示,采用 t检验,方差分析,组间用Bonferroni法进行多重比较。

2 结 果

2.1 血浆E-selectin水平 与对照组相比,脑梗死组血浆E-selectin水平明显升高(t=13.139,P＜0.05);与脑梗死无并发症组相比,合并高血压、高脂血症患者的血浆E-selectin水平也显著升高(P＜0.05),而并发高血压组和并发高脂血症组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1、表2。

表1 对照组与脑梗死组血浆E-选择素浓度比较(±s)

表1 对照组与脑梗死组血浆E-选择素浓度比较(±s)

组别 n E-selectin(ng/mL)对照组 85 13.80±5.37脑梗死组 73 44.62±19.411)与对照组相比,1)P＜0.05

表2 脑梗死各组间血浆E-选择素浓度比较(±s)

表2 脑梗死各组间血浆E-选择素浓度比较(±s)

项目 n E-selectin(ng/mL)无并发症组 15 27.54±10.54并发高血压组 35 46.56±21.521)并发高脂血症组 23 52.80±13.121)与并发症组相比,1)P＜0.05

2.2 E-选择素基因S128R多态性 PCR扩增产物片段大小186bp,根据限制性内切酶PstⅠ酶切片段的情况,基因型有3种,正常纯合子 SS型(63bp,123bp两条带),杂合子 SR型(63bp,123bp,186bp三条带),突变纯合子RR型(186bp一条带);为进一步证实结果,应用DNA基因测序进行验证评实了这一结果。

2.3 E-选择素基因型在两组人群中分布频率 经 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,达到遗传平衡,具有群体代表性。经χ2检验及相关分析,基因型、等位基因在脑梗死组和对照组的分布,差异存在统计学意义(P＜0.05);相对风险度分析,携带等位基因R患脑梗死的风险性是S的4.985倍(OR=4.985,95%CI:1.543～15.928)。详见表3。

表3 脑梗死组和对照组基因S128R多态性分析 例(%)

3 讨 论

动脉粥样硬化(AS)是脑梗死的高危因素之一,最近研究表明,AS可能是一种慢性炎症状态,且炎症反应贯穿了从脂纹形成到斑块破裂的全过程。E-选择素即人类白细胞分化抗原CD62E,由活化的血管内皮细胞合成,是唯一仅限于内皮细胞表面表达的诱导性黏附分子,属于选择素家族(SF);它介导活化的内皮细胞与白细胞的起始黏附,并锚定白细胞,继而介导白细胞活化,使白细胞在损伤区域滚动,引起一系列炎症反应,导致AS的形成[3]。在CD18、CD62E基因共同敲除的小鼠,表现出明显的炎症反应缺陷,白细胞的黏附率下降了95%,证明E-选择素在炎症反应中的作用不能被其他黏附因子所替代[4]。研究还发现,E-selectin与动脉粥样硬化斑块的不稳定性有关[5],而粥样斑块的不稳定性与脑梗死的发生发展紧密相关。因此,E-selectin与脑梗死的相关性研究成为目前的热点。

本实验发现,与正常对照组相比,脑梗死组血浆E-selectin浓度明显升高(P＜0.05),提示血浆E-selectin水平与脑梗死的发生有关,与Blann等[6]的报道一致。在脑梗死组,合并高血压、高脂血症的患者与无并发症组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05),可能是由于高血压和高血脂引起内皮损伤、功能失调,导致血管通透性增加,使活化的内皮表达大量的E-selectin所致;虽然高血压组和高脂血症组比较有一定的差异,但无统计学意义(P＞0.05)。

分子遗传学的研究表明,人E-selectin基因位于第1号染色体长臂上,为一段长13kb的DNA序列,含14个外显子和13个内含子;证实E-selectin基因第4外显子区128位点存在S/R多态性,这种基因多态性的存在可能影响E-selectin基因表达水平及生物学功能[2]。有研究证明E-selectin基因S128R多态性与多种疾病的易感性存在相关性,如冠心病[7]、心肌梗死[8]等,但是其否与脑梗死相关,国内外报道较少。

1994年德国学者Wenzel等[8]首先证实 E-选择素基因第561位碱基因腺嘌呤(A)/(C)(A561C)的转换,导致其分子128为氨基酸由丝氨酸(Ser)变成精氨酸(Arg)(S128R),而且A561C(S128R)的多态性与德国白种人早发的动脉粥样硬化有关。韦叶生等[9,10]报道E-selectin基因S128R多态性在广西壮族、汉族两民族差异有显著性,同时发现广西壮族人基因S128R多态性与IS存在相关性,等位基因R可能是广西壮族人IS发病的遗传易感基因。本研究结果显示,E-selectin基因S128R多态性在山西汉族人群脑梗死组和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);相对风险度分析,携带R等位基因患脑梗死的风险是S等位基因的4.958倍,说明E-selectin基因S128R多态性与山西汉族脑梗死易患性有关,R可能是山西汉族人脑梗死发病的易感因素。

脑梗死呈遗传易感性与环境因素相结合的发病模式,外界因素虽然可使发病率增高,但最终仍需通过遗传因素起作用。E-selectin基因多态性与脑梗死的研究尚处于起始阶段,由于存在种族、地域和个体差异问题,还需多样本、多地域进行深入的探讨,将有可能为脑梗死高危人群的筛查、早期诊断、干预和防治提供新的线索和一定指导意义。

[1]中华神经科学会,中华神经外科学会.各类脑血管疾病诊断要点[J].中华神经科杂志,1996,29(6):379-380.

[2]RauchhausM,Gross M,Schulz S,et al.The E-selectin SER128ARG gene polymorphism and restenosis after successful coronary angioplasty[J].Int J Cardiol,2002,83(3):249-257.

[3]Yoshida M,T akano Y,Sasaoka T,et al.E-selectin polymorphism associated with myocardial infarction causes enhanced leukocy teendothelial interactions under flow conditions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(5):783.

[4]Lwamura T,Caffery TC,Kitamura N,et al.P-selectin expression in a metastatic pancreatic tum or line(SUIT)[J].Cancer Research,1997,57:1206-1211.

[5]Atalar E,Ay temir K,Haznedaroglu I,et al.Increased plasma levels of soluble selections in patients with unstable angina[J].Int J Cardiol,2001,78(1):69-73.

[6]Blann A,Kumar P,Krupinski J,et al.Soluble intercellular adhesion molecule-1,E-selectin,vascular cell adhesion molecule-1 and von Willebrand factor in stroke[J].Blood Coagul Fibrinolysis,1999,10(5):277-284.

[7]Zheng F,Chevalier JA,Zhang LQ,et al.An Hphi polymorphism in the E-selectin gene is associated with premature coronary artery disease[J].Clin Genet,2001,59:58-64.

[8]Wenzel K,Felix S,Kleber FX,et al.E-selectin polymorphism and atherosclerosis:An association study[J].Hum Mol Genet,1994,3(11):1935-1937.

[9]韦叶生,徐群清,蒙兰青,等.E-选择素基因多态性与广西壮族人缺血性脑卒中的遗传易感性的关系[J].第三军医大学学报,2005,27(21):2160-2163.

[10]韦叶生,蓝艳,杜诗.广西壮族与汉族人群E-选择素基因的遗传多态性[J].中华医学遗传学杂志,2004,21(6):643-645.