肝细胞生长因子对糖尿病肾病不同阶段的治疗作用

孙喜明,李 兴,王桂英,田立华,张慧荣

糖尿病肾病已成为糖尿病患者死亡的主要原因,转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)在糖尿病肾病发病机制中起着重要作用,使细胞外基质(ECM)蛋白表达增多并抑制其降解。肝细胞生长因子(HGF)是近年来发现的一种肾营养因子。但HGF在糖尿病肾病中的作用仍是有争议的。本研究给予2型糖尿病肾病大鼠腹腔注射重组肝细胞生长因子 ,利用RT-PCR检测肾脏TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、c-metmRNA表达和病理变化,观察HGF对2型糖尿病肾病不同阶段的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 模型建立 4周～8周的雄性Wistar大鼠60只,体重220 g～250 g,随机分为对照组(NC组)、糖尿病肾病组(DN组)、治疗组(HGF组)。NC组和DN组大鼠 36只,喂以高糖、高脂饲料2月后,腹腔注射链尿佐菌素(STZ,由 Sigma公司提供),30 mg/kg。1月后,空腹血糖≥7.0 mmol/L,确定为2型糖尿病大鼠。HGF组共12只,糖尿病鼠成模后2个月,随机取6只给予HGF 500 μ g/(kg◦d),皮下注射,连续1个月,随后处死;另外6只于糖尿病鼠成模后6个月,给予hHGF 500 μ g/(kg◦d),皮下注射,连续1个月,随后处死。DN组:共24只,分别于糖尿病鼠成模后2个月、3个月、6个月、7个月后,随机取6只处死;对照组24只,喂以低糖、低脂饮食,随机取6只,分别与DN组同时处死。

1.2 血糖与尿蛋白的测定 每周测血糖1次。分别于注射后2个月、3个月、6个月和7个月在代谢笼中收集尿液,测定 24 h尿白蛋白排泄率。

1.3 TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、c-metmRNA 的表达 应用RT-PCD检测,引物序列由上海生物工程技术有限公司合成。经紫外凝胶图像分析仪进行数据分析,以目的基因mRNA扩增后产物的光密度值与GAPDHmRNA扩增后产物光密度值的比值作为目的基因mRNA表达的相对值。

1.4 病理观察 常规HE染色,在JEOL-100型透射电镜下观察肾小球基膜的改变。光镜下用M IAS-2000图像分析综合系统(四川大学图像图形研究所)测定肾小球体积。电镜照片亦采用该系统测定肾小球基膜平均厚度(GBM T)。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖变化 HGF组和DN组大鼠在注射STZ1个月后,空腹血糖≥7.0 mmol/L,且各组大鼠组间及不同时间相比差异无统计学意义。

2.2 各组大鼠尿白蛋白(Alb)的变化 HGF组和DN组大鼠于注射STZ2个月后尿白蛋白与对照组相比明显增加(P＜0.05),与人早期糖尿病肾病相似。3个月时,HGF组尿白蛋白无明显变化,但DN组尿白蛋白明显增加(P＜0.05);6个月时,HGF组和DN组出现大量的蛋白尿,与人临床糖尿病肾病相似,且HGF组与DN组相比差异无统计学意义;7个月时,HGF组尿白蛋白较6个月时尿蛋白明显减少,而DN组尿蛋白较6个月时明显增加(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠24 h尿白蛋白排泄率(±s)mg

表1 各组大鼠24 h尿白蛋白排泄率(±s)mg

组别 n 高热量饮食2个月 注射STZ1月 注射STZ2月 注射STZ3月 注射STZ6月 注射STZ7月对照组 6 3.88±0.78 4.60±0.59 4.58±0.58 4.68±0.54 4.64±0.62 4.76±0.68 DN 组 6 3.85±0.87 5.08±0.24 12.76±6.251) 17.26±0.72 24.24±1.081) 28.35±0.861)HGF组 6 3.89±0.83 4.73±0.70 13.65±3.581) 13.98±0.651)2) 25.23±0.581) 18.86±0.461)2)与对照组比较,1)P＜0.01;与DN组比较,2)P＜0.01

2.3 各组大鼠肾脏的病理变化 DN组大鼠2月时肾小球肥大,肾小球基膜和系膜基质轻度增加,可见少量的荒废肾小球;3个月时,DN组大鼠肾小球基膜和系膜基质进一步增厚,荒废的肾小球进一步增加,而HGF组大鼠肾小球基膜和系膜基质未见明显进一步增厚,荒废的肾小球未见明显增加。DN组大鼠6个月时GBM明显增厚,系膜基质明显增宽,可见大量荒废的肾小球,残余肾小球代偿性肥大;7个月时,DN组大鼠肾小球基膜和系膜基质进一步增厚,荒废的肾小球进一步增加,而HGF组大鼠肾小球基膜和系膜基质厚度较6个月时明显减轻,荒废的肾小球数量明显减少。详见表2。

表2 各阶段肾脏病理形态学的变化(±s)

表2 各阶段肾脏病理形态学的变化(±s)

时段 肾小球体积V(μ m3)肾小球基膜厚度GBM T(μ m)对照组 DN组 HGF组 对照组 DN组 HGF组高热量饮食2月 323±34 321±50 4 362±366 4 366±362注射STZ1月 320±31 367±351)注射STZ2月 299±30 402±292)4 604±1396 7 480±1 4661)注射 STZ3月 332±56 275±252) 389±652)4) 4 615±1 325 9 886±1 1382) 7 639±1 2371)2)3)注射 STZ6月 339±36 254±382) 4 357±1 021 1 1297±1 6892)注射 STZ7月 325±45 198±342) 279±331)4) 4 126±986 1 3867±1 6892) 8 565±1 3232)4)5)与对照组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与DN组比较,3)P＜0.05,4)P＜0.01;与DN组治疗前比较,5)P＜0.05

2.4 各组大鼠 TGF-β1,c-met及 CTGF mRNA的表达变化在3个月时,DN组 TGF-β1及CTGFmRNA表达较对照组及HGF组和 DN组 2个月时高。在 6个月时,DN组 c-met mRNA表达较3个月和2个月时进一步降低,TGF-β1及CTGFmRNA表达较3个月和2个月时显著增高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。在7个月时,HGF组 c-met mRNA表达较DN组6个月及7个月时高,TGF-β1及CTGFmRNA表达较DN组6个月及7个月时低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。详见图 1、图 2、图 3。

图3 各组大鼠c-met mRNA的表达

3 讨 论

糖尿病肾病的典型病理改变是肾小球硬化,而尿白蛋白是反映肾小球功能的主要指标。本研究建立糖尿病及2型糖尿病肾病大鼠模型。糖尿病大鼠2个月时,DN组和HGF组尿白蛋白排泄率(UAER)显著高于对照组,肾小球肥大,肾小球基膜和系膜基质轻度增厚,与人早期糖尿病肾病的发病相似。糖尿病大鼠6个月时出现大量蛋白尿,为非选择性蛋白尿,GBM明显增厚,系膜基质增宽,荒废的肾小球增多,残余肾小球代偿性肥大,与人临床糖尿病肾病相似。

大量实验研究表明,DN的发病实际上是多种细胞因子、生长因子及激素等对过高血糖的综合反映结果。生长因子如TGF-β1和CTGF在DN发病机制中起着重要作用,这些生长因子使细胞外基质(ECM)蛋白表达增多并抑制其降解[1],而ECM在肾小球的异常沉积是引起肾小球硬化的主要原因之一。高血糖、糖化终末产物和血管紧张素Ⅱ产生活性氧物质并刺激TGF-β1上调,TGF-β1反过来上调 CTGF的表达,也诱发高血糖。高血糖诱发了肾脏一系列事件,最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化[2]。肾小球硬化和肾间质纤维化是各种原因所致肾脏疾病进行性损害直至肾衰的最后共同通路。肾小球或肾小管间质损伤,炎性细胞侵入,促进纤维化的因子(TGF-β1、CTGF)生成增加,抑制纤维化的因子(HGF)生成减少,成肌纤维细胞形成及增殖,ECM积聚。在众多促纤维化的因子中,TGF-β1被认为是最重要的促纤维化因子之一,它在肾小球硬化和肾间质纤维化中扮演着极为重要的角色[3]。本实验观察到,糖尿病大鼠在3个月时,肾组织TGF-β1mRNA表达明显增高,同时蛋白尿进一步增加,并且随着时间的延长,TGF-β1mRNA的表达进一步增强,尿蛋白进一步增多,GBM和肾小球系膜进一步增厚。

CTGF曾被认为在纤维化过程中是TGF-β的下游调控因子[4]。然而,CTGF可不依赖TGF-β被诱导表达增高,大量研究表明高糖环境下,CTGF在肾小球膜细胞表达增加,导致ECM沉积[5]。CTGF在包括糖尿病肾病在内的多种肾病的肾脏纤维化中过度表达[1]。本实验观察到,糖尿病大鼠在3个月时,CTGFmRNA表达明显增高,并且随着时间的延长,CTGFmRNA的表达进一步增强,GBM和肾小球系膜进一步增厚,即:CTGFmRNA的表达与糖尿病肾病肾脏纤维化密切相关。CTGF和 TGF-β1使ECM 蛋白表达增多并抑制其降解,造成细胞肥大,最终导致肾脏纤维化。

HGF是近年来发现的一种肾营养因子。HGF是间质来源的多效性生长因子,在多种慢性肾病中具有抗纤维化和促进再生的功能。HGF的作用是由其受体c-met介导的,c-met属于氨酸激酶受体超家族[6]。

在急性和慢性肾衰的情况下,HGF通过促进细胞的生长、促进实质细胞中间质结构的有序化来参与损伤和纤维化后肾组织的重修和再生,发挥其预防和治疗的作用[7]。因此,补充给予HGF以降低TGF-β和CTGF水平从而治疗肾纤维化和慢性肾衰。本实验给予早期糖尿病肾病大鼠HGF治疗,抑制了TGF-β1和CTGFmRNA表达的上调,虽然早期糖尿病大鼠肾脏的形态和功能未见明显改善,但是早期糖尿病大鼠的尿蛋白未见明显增加、GBM和系膜基质未见进一步增厚;这可能与TGF-β1破坏肾小球滤过膜的电荷屏障及分子屏障,而此时肾脏纤维化较轻有关;因而HGF可抑制早期糖尿病肾病的进一步发展。

在糖尿病肾病的治疗中,HGF可通过上调c-metmRNA的表达,抑制TGF-β1和 CTGF等致纤维化生长因子的作用的途径来抑制糖尿病肾病肾间质纤维化,而起到保护肾结构和维护肾功能的作用,具有良好的临床应用前景。

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