丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后caspase-8表达及凋亡活性的影响1)

胡 琼,刘瑞珍

脑缺血再灌注是大多数缺血性脑血管病的主要生理病理过程,其中细胞凋亡是主要环节[1]。caspase-8是介导死亡受体通路和线粒体通路两条凋亡途径的关键性酶,活化的 caspase-8能激活两条凋亡通路下游的caspase,扩大凋亡信号,从而引发致死性的蛋白分解级联反应[2]。丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP)能够有效的抑制急性脑缺血性损伤的多个病理环节,在脑缺血再灌注损伤凋亡中起关键作用[3]。本实验旨在观察丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤中caspase-8蛋白表达的研究,探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性 Wistar大鼠180只,体重200 g～250 g,由山西医科大学生理教研室动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 丁苯酞石药集团恩必普药业有限公司提供,批号:08100111。caspase-8单克隆抗体购自 Santa Cruz公司,二抗及Tunel细胞凋亡检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)由山西医科大学生理教研室提供。

1.3 方法

1.3.1 局灶性脑缺血再灌注模型建立 缺血再灌注模型采用改良的Zea Longa大脑中动脉闭塞(MCAO)模型制备[4,5]。

1.3.2 实验动物分组 实验动物随机分为5组:假手术组(n=36);缺血1 h再灌注组(n=36);NBP治疗组(n=36):缺血再灌注1 h后给予腹腔注射NBP 80 mg/kg[6];NBP预防组(n=36):给予NBP 80 mg/kg灌胃,每日1次,1周后行脑缺血再灌注模型的制备;NBP预防治疗组(n=36):给予NBP 80 mg/kg每日1次灌胃,1周后行缺血再灌注术后1 h给予腹腔注射NBP80 mg/kg。假手术组和缺血1 h再灌注组术后1 h给予等剂量的0.5%Tween80溶剂。每组又按处死时间点分为 6 h、12 h、24 h 3个亚组,每个亚组12只。

1.3.3 神经功能缺失体征评分 缺血1 h再灌注6 h、12 h、24 h后观察大鼠神经功能缺失状态,用单盲法进行Zas-Longa的5分制法评分[4]。采用大鼠手术麻醉清醒后神经功能缺损1分～3分且无蛛网膜下腔出血的动物进行试验。0分、4分或死亡剔除,再随机补充。

1.3.4 标本留取 Western blot检测的标本留取,各组动物分别于相应时间点将大鼠麻醉后直接断头取脑,去除正常的一侧大脑及小脑,放于-70℃冰箱中保存。

1.3.5 免疫组织化学染色 将组织石蜡块切片,脱蜡、抗原修复、滴加 1∶200的 caspsae-8抗体,加二抗,DAB显色,苏木素复染。每张片子在400倍显微镜下,随机取左侧大脑半球缺血区10个视野,计算其阳性细胞的灰度值。

1.3.6 Western blot测定 将收集的组织标本取100 mg放入1.5 mL离心管内,加蛋白裂解液1 mL(RIPA裂解缓冲液),置温浴中超声匀浆,10 000 r/min,离心5 min后取上清加入等体积的2×SDS buffer,煮沸5 min,迅速冰浴,10 000 r/min,离心5 min,取上清用于后面实验。进行蛋白电泳分析。应用QUAN TITYONE(Bio-Rad)软件进行光密度定量,所得结果以β-actin为参考。

1.3.7 TUNEL法检测细胞凋亡 凋亡程度以每个视野中TUNEL阳性细胞数表示,每张切片随机取6个～8个视野进行观察。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件。计量资料均以均数±标准差(±s)表示,多个样本均数比较采用单因素方差分析,任意两组之间的比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1 神经功能缺失体征表现 脑缺血再灌注24 h后在大鼠静息状态下神经功能缺失表现为左前肢屈曲,肌张力降低,侧推阻力降低;活动减少,自发向左侧追尾转圈;可伴或不伴有右侧Horner征。假手术组无神经功能缺失症状,缺血再灌注组出现明显的神经功能缺失症状。与缺血再灌注组比较,NBP治疗组及NBP预防治疗组能明显改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失症状,NBP预防组对缺血再灌注损伤后的神经功能缺失症状有所改善且大鼠脑缺血再灌注术后清醒快,清醒后精神状态明显比缺血再灌注组好。

2.2 病理形态观察(HE染色)假手术组脑组织HE染色,皮质和海马区组织结构清晰严密,神经细胞形态结构正常。缺血再灌注组缺血侧出现范围较大的梗死灶,甚至在病理切片上几乎占据整个大脑半球的梗死灶,梗死灶核心区域成筛状改变,组织结构消失;海马组织结构明显异常,细胞排列紊乱、数目减少、皱缩变形。与缺血再灌注组比较,NBP治疗组海马组织细胞排列略呈紊乱,细胞皱缩变形、胞核固缩等表现明显减轻。NBP预防组与缺血再灌注组病理形态学改变亦有差别,其凋亡程度较其轻。NBP预防治疗组光镜下与NBP治疗后的病理形态学改变无明显差异。

2.3 Caspase-8的表达 假手术组偶见散在caspase-8阳性细胞。与假手术组比较,缺血再灌注组不同时间点出现大量caspase-8阳性细胞,广泛分布于皮质和海马组织梗死灶周边区域(P＜0.05),主要在神经元胞浆中表达,部分核内也可见。NBP治疗组、预防组及预防治疗组的caspase-8阳性细胞数明显减少,与缺血再灌注组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。NBP预防治疗组与NBP治疗组比较,在缺血再灌注后6 h、12 h时caspase-8的表达,治疗组少于预防治疗组(P＜0.05)。详见表1。

表1 大鼠脑皮层caspase-8表达的平均灰度值比较(±s)

表1 大鼠脑皮层caspase-8表达的平均灰度值比较(±s)

组别 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手术组 36 177.47±1.67 177.57±1.17 177.49±1.08缺血再灌注组 36 154.71±0.97 150.59±1.181) 146.66±1.102)NBP治疗组 36 168.26±1.193) 170.41±1.112)3) 175.87±0.902)3)NBP预防组 36 157.61±0.923)4) 160.29±1.252)3)4) 165.36±1.222)3)4)NBP预防治疗组 36 169.25±0.963)5) 172.50±0.842)3)4) 176.19±1.262)3)与假手术组比较,1)P＜0.05;与前一时间点比较,2)P＜0.01;与缺血再灌注组比较,3)P＜0.01;与治疗组比较,4)P＜0.05

2.4 Western blot测定结果 正常大鼠及假手术组中脑组织caspase-8活性片段的蛋白表达量很低。缺血再灌注组caspase-8蛋白的表达量明显上调(P＜0.05)。NBP治疗组、预防组及预防治疗组的蛋白表达明显低于缺血再灌注组(P＜0.01),NBP预防组的Caspase-8蛋白表达与缺血再灌注组比较,表达量有所减少,但不如治疗组下调明显(P＜0.05);预防治疗组在缺血再灌注24h表达与治疗组无统计学意义(P＞0.05)。

表2 Western印迹缺血再灌注24 h caspase-8表达(±s)

组别 caspase-8/beta正常组 0.668±0.026假手术组 0.670±0.015缺血再灌注组 1.101±0.0171)NBP治疗组 0.730±0.0282)NBP预防组 0.816±0.0232)3)NBP预防治疗组 0.736±0.0402)4)与任一组比较,1)P＜0.05;与缺血再灌注组比较,2)P＜0.01;与治疗组比较,3)P＜0.05

3 讨 论

人的脑组织对缺血以及再灌注均非常敏感,易发生缺血再灌注损伤。脑组织发生缺血性改变后,梗死灶中心以细胞死亡为主,而在梗死灶边缘,细胞的丢失则以凋亡为主。因而,有效地减少细胞过度凋亡可以减轻缺血再灌注对组织器官的损伤。

caspase家族是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶。脑缺血后发生的神经元凋亡其信号转导机制十分复杂,目前认为主要有两条信号转导通路,即死亡受体通路和线粒体通路,而这两条通路都以caspase-8基因的激活为特征。本实验结果证明,大鼠脑缺血再灌注后,各组中caspase-8蛋白质的表达水平明显升高,而且分布及动态演变规律与缺血后神经元凋亡的变化基本一致,提示此蛋白参与了脑缺血再灌注后神经元凋亡的发生和发展。因此对caspase-8蛋白质进行早期干预,有可能避免或降低凋亡的发生,从而减轻缺血性损伤。

NBP是人工合成的消旋体,其左旋体存在于芹菜籽中。现代药理研究表明,NBP可增加缺血区脑血流。

本实验观察到,caspase-8在缺血再灌注后随时间的延长,表达持续增高,随着再灌注时间的延长,其主要表达在缺血周围区域,提示caspase-8可能参与缺血后神经元凋亡的病理生理过程。假手术组可偶见散在caspase-8阳性细胞,可能与手术创伤刺激有关。丁苯酞治疗组及预防治疗组可明显改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤引起的神经功能缺失症状和脑组织的病理损害,还可以显著减少各时间点梗死灶周边缺血半暗带区神经元caspase-8的表达。丁苯酞预防组与缺血再灌注组比较,同样能下调caspase-8蛋白的表达量,但较治疗组及预防治疗组效果较差,提示 NBP提前预防给药可以适当减少caspase-8的表达,从而有一定的预防缺血性脑血管病的作用。

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