AngⅡ对THP-1源巨噬细胞高密度脂蛋白受体表达的影响

李 芳,杨志明,肖传实,康玉明

动脉粥样硬化(AS)的发生发展是一个极其复杂的病理生理过程,血脂代谢紊乱与其密切相关,血浆脂质水平升高可促使大量脂质尤其是胆固醇进入动脉壁,最终导致AS病变形成。胆固醇逆转运(RCT)过程对机体具有抗AS的保护作用。SR-B1是一种高密度脂蛋白(HDL)生理性相关受体,是第一个在分子水平上得到证实的HDL受体。已有研究证实,RCT过程中包括细胞胆固醇的流出等关键步骤均需SR-B的参与[1]。

肾素-血管紧张素系统(RAS)参与了AS的发生过程。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分,是一种加速AS成的重要危险因子[2]。Wolf等[3]的研究首次发现,AngⅡ能下调近端肾小管细胞SR-B1的表达。有关AngⅡ对巨噬细胞SRB1表达的影响尚未见报道。本研究拟以THP-1源性巨噬细胞为对象,观察AngⅡ对THP-1源性巨噬细胞SR-B1表达的影响,探讨AngⅡ促进AS的新机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人THP-1单核细胞(购自中科院上海细胞库);AngⅡ、佛波脂(PMA)均为美国 Sigma公司产品;RPMI1640培养基、胰蛋白酶(美国GIBCO/BRL公司);总 RNA提取试剂盒(Trizol)美国Promega公司;SR-BI引物、β-actin引物(内参)大连宝生物有限公司;胎牛血清(杭州四季青公司);兔抗人SR-B1多克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 THP-1细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,37℃、5%CO2培养箱中静置培养,在每次实验前用160 nmol/L PMA孵育 THP-1细胞 36 h,使其诱导分化成巨噬细胞。分组并计数,实验共分5组,即对照组(AngⅡ0 nmol/L)、AngⅡ10 nmol/L、AngⅡ100 nmol/L、AngⅡ1000 nmol/L、AngⅡ10000 nmol/L,各组作用24 h后收集细胞,用于SR-B1表达的检测。

1.2.2 RT-PCR法检测THP-1巨噬细胞SR-B1mRNA表达T rizol法提取总RNA,SR-B1表达水平以目的mRNA与内参照人β-actin灰度值之比表示。引物序列由大连宝生物有限公司合。人THP-1巨噬细胞SR-B1引物序列,上游引物:5'-ctgtgggtgagatcatgtgg-3',下游引物:5'-gttccacttgtccacgaggt-3',扩增片段 191bp;人β-actin引物序列,上游引物:5'-tgaacgggaagctcactgg-3',下游引物:5'-tccaccaccctgttgctgga-3',扩增片段为307bp。取各组细胞总 RNA 2 μ g反转录合成 cDNA,再取反转录产物1 μ L进行PCR循环。反应结束后,取反应产物5 μ L进行2.0%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色,UVP凝胶图像分析系统扫描摄图分析。

1.2.3 Western-blot蛋白印迹法检测THP-1巨噬细胞 SR-B1蛋白表达 用细胞裂解液裂解细胞,取总蛋白50 μ g进行变性,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2 结 果

2.1 巨噬细胞的分化鉴定 细胞呈圆形、悬浮生长,经160 nmol/LPMA诱导分化36 h后,细胞停止增殖,由悬浮生长变为贴壁生长,且伸展伪足,呈巨噬细胞外形。

2.2 THP-1巨噬细胞SR-B1表达的检测 THP-1巨噬细胞与不同浓度 AngⅡ(对照组 0 、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L)孵育24 h后,RT-PCR检测 T HP-1巨噬细胞SR-B1mRNA的表达。结果显示,与对照组相比,AngⅡ使THP-1巨噬细胞SR-B1mRNA的表达下调,且呈剂量依赖关系(P＜0.05)。详见表1。

Western印迹方法检测各组细胞SR-BI蛋白质的表达。结果显示,与对照组相比,AngⅡ使THP-1巨噬细胞SR-B1蛋白质的表达下调,且呈剂量依赖关系(P＜0.05)。详见表2。

表1 各组 THP-1源巨噬细胞SR-B1 mRNA表达(±s)

表1 各组 THP-1源巨噬细胞SR-B1 mRNA表达(±s)

组别 n SR-B1对照组 6 0.86±0.05 10 mmol/L组 6 0.65±0.071)100 mmol/L组 6 0.47±0.031)1 000 mmol/L组 6 0.35±0.031)10 000 mmol/L组 6 0.24±0.031)与对照组相比,1)P＜0.05

表2 各组 THP-1源巨噬细胞SR-B1蛋白表达(±s)

表2 各组 THP-1源巨噬细胞SR-B1蛋白表达(±s)

组别 n SR-B1对照组 6 1.17±0.04 10 mmol/L组 6 0.89±0.021)100 mmol/L组 6 0.77±0.021)1 000 mmol/L组 6 0.61±0.021)10 000 mmol/L组 6 0.49±0.021)与对照组相比,1)P＜0.05

3 讨 论

冠心病是人类排列前位的主要致死原因,国际著名的七国研究、美国弗莱明汉心脏研究和多危险因素干预试验(MRFTI)均证实血浆胆固醇水平的升高是冠心病发生率、死亡率增高的最重要危险因素。研究SR-B1缺失的小鼠发现,不仅肝脏选择性摄取胆固醇降低,AS损伤加剧,而且动物易发冠心病并伴随自发的心肌梗死、心力衰竭和死亡[4]。巨噬细胞SR-B1的表达对apoE-/-小鼠体内的动脉粥样硬化病变的进展有保护作用[5]。因此SR-B1的表达调控可能在AS的形成中起重要作用,如何调控SR-B1成为人们关注的焦点。研究证实,SR-B1在肝脏细胞、类固醇激素生成细胞或巨噬细胞的表达可因给予雌激素,过氧化物酶体增殖物活化受体拮抗剂、维生素E、多聚不饱和脂肪酸、胆固醇等而改变[6],然而对AS的形成与发展起重要促进作用的AngⅡ是否对SR-B1表达有调控作用尚不清楚。

本实验显示,AngⅡ能显著抑制巨噬细胞SR-B1mRNA的表达,并呈剂量依赖性(P＜0.05)。同样AngⅡ能显著抑制巨噬细胞SR-B1蛋白的表达,且呈剂量依赖性(P＜0.05),并且其蛋白表达水平同mRNA表达水平一致。

本研究结果显示,AngⅡ对T HP-1源性巨噬细胞SR-B1具有负性调控作用。因此AngⅡ促进AS的一个重要机制就是通过抑制SR-B1的表达,从而使巨噬细胞胆固醇逆转运受阻,导致动脉粥样硬化病变形成。

[1]Acton SL,Kozarsky KF,Rigotti A.The HDL receptor SR-B1:A new therapeutic target for atherosclerosis[J].Molecular Medicine Today,1999,5:518-524.

[2]Gorte K,Drexler H,Schieffer B.Rennin agiotensin systemn and atherosclerosis[J].NePhrol Dial Transplant,2004,19(4):770-773.

[3]Wolf G,Wenezl U,Jablonski K,et al.AngioetnsinⅡdown-regulates SR-B1 HDL receptor in proximal tublar cells[J].NePhrol Dial T ransplant,2005,20(6):1222-1227.

[4]Trigatti B,Covey S,Rizvi A.Scavenger receptor class B ty pe I in high-density lipoprotein metabolism,atherosclerosis and heart disease:Lessons from gene-targeted mice[J].Biochem Soc Trans,2004,32P(t1):116-120.

[5]Zhang W,Yancey PG,Su YR,et al.Inactivation of macrophage scavenger receptor class B ty pe I promotes atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice[J].Circulation,2003,108(18):2258-2263.

[6]Krieger M.Charting the fate of the“ good cholesterol” :Identification and characterization of the high-density lipoprotein recepto r SR-B1[J].Annu Rev Biochem,1999,68:523-558.