白芍总苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用及对GRP78表达的影响

郭道华,韦颖梅,王小静,叶 云

缺血性心肌病是危害人类健康的最常见疾病之一,随着急诊溶栓和冠状动脉旁路移植术等再灌注治疗的开展,心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的治疗成为临床上疗效不佳的一个重要原因,再灌注时产生的氧自由基和细胞内钙超载可能是心肌缺血再灌注损伤重要的发病环节,有研究证明内质网应激参与了缺血再灌注性损伤[1],葡萄糖调控蛋白(glucose-regulated protein78,GRP78)是内质网应激的伴侣分子,具有减轻内质网负担、保护内质网的功能。白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)是从传统中药白芍中提取的有效成分,主要含有芍药苷、芍药新苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等成分。现代药理证明,TGP具有抗炎、免疫调节、镇静、镇痛、耐缺氧、抗氧化和抗心肌缺血等作用[2-4],临床上常用于免疫、风湿疾病的治疗。本实验通过观察白芍总苷作用下心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能及GRP78表达的变化,来探讨白芍总苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及对GRP78的表达影响。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 48只成年 SD大鼠,雌性,体重250 g～280 g,由蚌埠医学院动物实验中心提供;白芍总苷粉剂和羧甲基纤维素钠由安徽医科大学临床药理研究所惠赠;葛根素(三东瑞阳制药有限公司,批号:03020001);Powerlab/16sp数据采集和分析多导系统:AD Instruments Australia产品;DH-140B动物人工呼吸机:浙江医科大学医学仪器实验厂产品,GRP78多克隆抗体:(Santacruz)公司

1.2 心肌缺血再灌注损伤的模型建立 取SD大鼠称重,术前12 h禁食,腹腔注射20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉,针状电极插入左前肢、右前肢、左后肢皮下,连续监测Ⅱ导联心电图。颈正中切开,于3～4气管软骨环间切开并行插管接动物呼吸机正压控制呼吸,结扎右颈总动脉远心端。监测心功能参数。以心电图显示ST段抬高、QRS波变高变宽和心肌变为青紫色为结扎成功的标志。

1.3 实验分组 将大鼠随机分为6组,每组8只。假手术组(sham组):LAD穿线但不结扎,旷置 90 min,术前1周用0.5%的羧甲基纤维素钠灌胃。模型组(I/R):缺血30 min再灌注90 min,术前1周用0.5%的羧甲基纤维素钠灌胃。TGP组:50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg TGP 分别灌胃 一周;葛根素(PUE组):100 mg/kg PUE于再灌注前5 min经右颈总推注。

1.4 观察指标 观测缺血前、缺血30 min、再灌90 min时心率(HR)、左心室收缩峰压(LVSP)、左心室压力变化最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 Western blot法 根据整个实验模型的特点及统计学分析的要求采用每组4个标本,具体方法:匀浆大鼠M/I处心肌组 织 ,提取 蛋白 ,用BCA法蛋白 定量 ,取 20 μ L样 品,SDS-PAGE电泳分离蛋白,湿转移法将蛋白条带转移至PVDF膜上(Millipore-Corporation),50 g/L脱脂奶粉封闭后依次加入一抗(GRP78抗体体积比1∶300)、二抗(碱磷酶标记的山羊抗兔体积比1∶6 000)

2 结 果

2.1 TGP和PUE对大鼠心肌缺血再灌注损伤血流动力学的影响 模型组在缺血30min后以及再灌注90min后,LVSP和±dp/dtmax均明显下降,LVEDP明显上升(P＜0.05),说明心脏的舒缩功能明显受损。与I/R组相比,不同剂量的TGP组与葛根素组相对应时间点的 LVSP和 ±dp/dtmax均能不同程度的提高、LVEDP不同程度的降低(P＜0.05),提示TGP可使缺血再灌注损伤所致的心脏舒缩功能障碍明显减轻。详见表1～表4。

表1 白芍总苷对I/R大鼠心率的影响(±s)/min

表1 白芍总苷对I/R大鼠心率的影响(±s)/min

组别 剂量 n 结扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham 组 - 10 320.00±21.23 310.80±16.48 300.65±11.15 I/R组 - 10 310.78±18.59 299.67±12.651) 273.76±18.281)TGP组 50 mg/kg 10 329.49±22.50 314.42±19.87 302.88±22.43 100 mg/kg 10 319.03±21.54 303.43±15.18 292.83±17.93 200 mg/kg 10 310.33±16.04 293.08±20.88 281.61±22.83 PUE组 100 mg/kg 10 323.33±19.02 300.16±12.69 300.93±16.79与Sham组比较,1)P＜0.05

表2 白芍总苷对I/R大鼠+dp/dtmax的影响(±s)mmHg/s×10-3

表2 白芍总苷对I/R大鼠+dp/dtmax的影响(±s)mmHg/s×10-3

组别 剂量mg/kg n 结扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham组 - 8 4.11±0.23 4.02±0.25 3.95±0.15 I/R组 - 8 4.08±0.29 3.15±0.271) 3.37±0.181)TGP组 50 mg/kg 8 3.98±0.50 3.32±0.172) 3.43±0.212)100 mg/kg 8 4.03±0.54 3.49±0.182) 3.63±0.132)200 mg/kg 8 4.07±0.24 3.67±0.212) 3.81±0.292)PUE组 100 mg/kg 8 4.10±0.13 3.66±3.692) 3.83±0.262)与Sham组比较,1)P＜0.05;与I/R组比较,2)P＜0.05

表3 白芍总苷对I/R大鼠-dp/dtm ax的影响(±s)mmHg/s×10-3

表3 白芍总苷对I/R大鼠-dp/dtm ax的影响(±s)mmHg/s×10-3

组别 剂量 n 结扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham组 - 8 3.16±0.23 3.05±0.15 2.96±0.15 I/R组 - 8 3.13±0.26 1.97±0.371) 2.08±0.331)TGP组 50 mg/kg 8 3.08±0.34 2.27±0.242) 2.44±0.172)100 mg/kg 8 3.06±0.23 2.41±0.202) 2.65±0.182)200 mg/kg 8 3.11±0.54 2.74±0.432) 2.89±0.492)PUE组 100 mg/kg 8 3.04±0.33 2.67±0.352) 2.93±0.382)与Sham组比较,1)P＜0.05;与I/R组比较,2)P＜0.05

表4 白芍总苷对I/R大鼠LVSP的影响(±s)mmHg

表4 白芍总苷对I/R大鼠LVSP的影响(±s)mmHg

组别 剂量 n 结扎前 缺血30 min 再灌90 min Sham组 - 8 127.4±4.2 126.8±3.8 123.6±6.5 I/R组 - 8 128.7±4.7 91.5±2.21) 97.1±2.71)TGP组 50 mg/kg 8 127.8±3.8 99.4±2.62) 108.8±2.52)100 mg/kg 8 132.3±4.1 104.4±3.12) 110.3±3.42)200 mg/kg 8 127.9±3.0 115.4±2.62) 121.1±3.72)PUE组 100 mg/kg 8 131.3±4.2 118.1±3.12) 125.9±2.72)与Sham组比较,1)P＜0.05;与I/R组比较,2)P＜0.05

2.2 白芍总苷对I/R大鼠GRP78表达的影响(见图1)

图1 白芍总苷对I/R大鼠G RP78表达的影响

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤作为一种应激源可引发心肌细胞内质网应激[5],GRP78位于心肌细胞的内质网上,可参与这一过程。具体情况是当组织器官在缺血、缺氧、低糖、内质网钙平衡紊乱等情况下,可导致GRP78大量表达[6],同时它与内质网中错误折叠蛋白和未折叠蛋白结合恢复蛋白质正确构象,修改其构型,维持新生肽的折叠、移位、组装、分泌,保持细胞在应激状态下蛋白质继续合成,维持内环境稳定,因此,GRP78在应激条件下对细胞起保护作用[7]。

本研究中血流动力学的观察表明,3种剂量组的白芍总苷可以明显改善心功能并可减轻缺血再灌注损伤对心功能产生的影响。缺血再灌注初期GRP78的上调提示缺血再灌注导致内质网发生应激反应,内质网应激反应启动后,GRP78发挥分子伴侣蛋白的作用,通过修复错误折叠蛋白以及未折叠蛋白,减轻内质网的负荷使细胞得以存活,再灌注90 min不同用药组GRP78表达的情况不一致,其中小剂量、中剂量和高剂量的白芍总苷治疗组中GRP78的表达明显高于模型组的表达,这说明白芍总苷对在体缺血再灌注大鼠心肌GRP78蛋白的表达有一定的影响,这一影响可能通过上调GRP78的表达,来对抗缺血应激损伤而发挥其保护作用。

本实验表明,白芍总苷可能通过促进缺血再灌注损伤组织GRP78的表达,发挥早期内源性的保护作用,但其详细机制并不十分清楚,可能与白芍总苷有扩张血管,降低血流阻力,改善心肌组织细胞的缺氧状态,促进ATP的合成有关,因GRP78的合成需要消耗大量的ATP,而当ATP的量增加时,GRP78的表达量发生上调,这样就会进一步发挥其保护作用,减轻缺血再灌注损伤。但其如何有效调节并在心血管疾病中得到广泛运用有待进一步的研究。

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