丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注后凋亡诱导因子的影响

王彦平,杨金升,范 磊,张明磊,司江华,曲传勇

缺血性脑血管病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一,脑缺血损伤是一个复杂的病理生理过程,其中再灌注损伤导致的神经元凋亡已经受到人们的广泛重视,如何减轻再灌注损伤成为治疗急性缺血性卒中的重要任务之一,本实验研究了丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响,以期为丹红注射液治疗缺血性脑血管病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠,鼠龄3个月～4个月,体重250 g～320 g,由兰州军区兰州总医院实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 丹红注射液由济南步长制药有限公司生产,AIF兔多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司),即用型SABC免疫组化染色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司),TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司)。

1.3 方法 实验动物随机分为假手术组、局灶性脑缺血再灌注组(对照组)、丹红注射液治疗组(治疗组)。治疗组予丹红注射液5 mL/kg,于术前30 min腹腔注射,每日1次,连续5 d。对照组给予等量生理盐水。

1.4 动物模型的建立 模型制作根据Nagasawa等[1]的改良线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血模型。用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,将其仰卧固定,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA),结扎ECA与CCA,用动脉夹夹闭CCA远心端后,迅速于ECA与ICA分叉下方剪一切口,将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉,插入深度为(18.5±0.5)mm,直到有轻微阻力感为止,实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处,尼龙线外留约1 cm,缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至略有阻力,实现大脑中动脉再灌注,造模完成。动物清醒后,出现Horner征,提尾右前肢屈曲或爬行向左侧转圈者为手术成功标志。假手术组除插线1 cm外,其余步骤同模型组。

1.5 标本采集和组织切片的制备 各组大鼠在规定时间点取材,假手术组于手术后24 h取材,其余各组在相应时间点取材。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,经左心室插管至升主动脉,剪开右心耳,依次灌注生理盐水、40 g/L多聚甲醛各300 mL,断头取脑,置入40 g/L多聚甲醛固定 12 h,于视交叉后 1 mm～4 mm取材,厚约3 mm,常规石蜡包埋,冠状面连续取材,取齿状回与海马互包平面的切片,片厚 4μ m。

1.6 凋亡诱导因子(AIF)的免疫组化标记 免疫组化采用SABC法。石蜡切片脱蜡至水,放入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中,微波热修复15 min,3%H2O2室温孵育 10 min,10%山羊血清封闭,室温孵育10 min,倾去血清,勿洗,滴加1∶200兔抗鼠AIF抗体,4℃冰箱孵育过夜,37℃复温1 h,滴加适量生物素标记羊抗兔二抗工作液,37℃孵育20 min;滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃孵育15 min。除血清封闭外,其余步骤间均用PBS冲洗3次,每次 5 min。DAB显色剂显色 2 min～5 min。自来水冲洗,苏木精复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。显微镜下观察,细胞核中出现棕黄色颗粒者为AIF阳性细胞。阴性对照取PBS代替一抗,免疫反应阴性,说明一抗的特异性较强。

1.7 凋亡细胞检测 按照TUNEL试剂盒提供的实验步骤进行操作。用二甲苯浸洗2次,每次5 min;用梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)脱水,每次 3 min;PBS漂洗2次;用细胞通透液(0.1%Triton X-100溶于蒸馏水,临用前配制)37℃反应8 min～10 min;PBS漂洗 2次;制备体积比为 1∶9的TdT和荧光素标记的dUTP TUNEL反应混合液混匀;玻片干后,加50 μ L TUNEL混合液(阴性对照组仅加 50 μ L荧光素标记的dUTP液)于标本上,在暗湿盒中反应(37℃×1 h)。PBS漂洗3次;加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450 nm～500 nm,检测波长为515 nm～565 nm)并照相;玻片干后加50 μ L converter-POD在37℃暗湿盒中反应33 min,PBS漂洗3次;在组织处加50 μ L新鲜配制的 DAB底物,室温下反应5 min～10 min;PBS漂洗3次;每次漂洗为5 min。苏木精复染几秒后,立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光镜下观察,出现棕黄色颗粒为阳性细胞。显微镜下观察顶叶皮质缺血半暗带区,取5个非重叠视野,以计数凋亡细胞数/视野。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。试验数据用均数±标准差(±s)表示,采用成组 t检验显著性检验水准取α=0.05。

2 结 果

2.1 AIF的表达 AIF阳性细胞呈棕黄色,假手术组大鼠脑组织中未见明显的AIF阳性细胞。对照组与治疗组AIF阳性细胞在缺血再灌注1 d达到高峰,随后下降;对照组与治疗组在相同时间点及其组间比较比较均有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 大鼠缺血再灌注后AIF阳性细胞表达(±s)

表1 大鼠缺血再灌注后AIF阳性细胞表达(±s)

组别 n I/R 1 d I/R 3 d I/R 5 d对照组 6 124.53±9.09 84.13±8.96 53.97±6.09治疗组 6 93.80±7.95 74.07±7.23 47.03±5.77 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 凋亡细胞检测 TUNEL检测凋亡细胞,凋亡细胞荧光显微镜显示为绿色,DAB显色后,出现棕黄色颗粒者为凋亡细胞,正常细胞核无着色,主要在缺血周围区,假手术组未见明显阳性细胞。对照组与治疗组TUNEL凋亡细胞在缺血再灌注1 d达到高峰,随后下降;治疗组与对照组比较,凋亡细胞明显减少,在相同时间点比较均有统计学意义(P＜0.05)。详见表2。

表2 大鼠缺血再灌注后T UNEL凋亡细胞(±s)

表2 大鼠缺血再灌注后T UNEL凋亡细胞(±s)

组别 n I/R 1 d I/R 3 d I/R 5 d对照组 6 102.50±9.54 76.20±8.11 45.80±5.46治疗组 6 82.53±8.69 67.63±5.83 40.57±4.22 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

神经元凋亡在脑缺血再灌注继发的神经损伤的机制中起重要作用。因此,通过抑制神经元凋亡防治脑缺血再灌注继发神经元损伤成为研究脑保护的热点。细胞凋亡的发生是一个极其复杂的病理生理过程,涉及能量衰竭、酸中毒、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性作用和自由基损伤等[2],但就其机制来说有Caspase依赖途径及AIF介导的非Caspase依赖途径。AIF是近年来发现的一种凋亡效应分子,它是一种在进化上较为保守的黄素蛋白,定位于细胞线粒体膜间隙,具有凋亡诱导的活性。AIF是一种双功能蛋白,具有氧化还原酶的活性,与线粒体的生理活动有关[3],它在不依赖Caspase途径中扮演重要角色。

丹红注射液是目前较为常用的临床药物,它由中药红花和丹参科学提取精制而成,主要成分为红花黄色素、丹参酮和丹参酚酸等。丹参可以使缺血再灌注的脑组织表达iNOS明显下降,从而减轻NO的神经毒性,保护脑组织[4],红花黄色素也可以降低iNOS和nNOS的表达,而对eNOS的表达无影响[5]。丹参酚酸和红花有抑制血小板黏附、聚集、激活的作用,以及能抗血栓形成,改善微循环等作用[6],其抗血小板作用可能通过抑制血小板的活化,减少GPⅡ b/Ⅲa受体的激活,从而减少血小板聚集,有效改善脑血流。丹红注射液还可提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,减少丙二醛(MDA)含量,从而减轻氧自由基对脑组织的毒害,并有效清除缺血再灌注后自由基对神经细胞继发损伤[7]。丹红注射液具有扩张脑动脉,降低血管阻力,降低血液黏度,增强红细胞变形能力,并能清除氧自由基,拮抗Ca2+内流,改善酶活性,同时也可提高脑组织耐氧能力,对脑组织具有明显的保护作用[8]。已有的研究发现,丹红注射液具有明显减少脑梗死体积,明显降低脑组织含水量[7],并可显著改善神经功能缺损评分及预后[9]。本实验证实,丹红注射液可显著减少凋亡细胞及AIF阳性细胞表达,对脑缺血再灌注损伤有积极的治疗作用。

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