大鼠脑挫伤后脑组织NF-κ B表达与损伤时间的关系1)

郭文平,梁新华,焦 炎

创伤性颅脑损伤作为现实生活中造成人类死亡的主要原因之一,是医学研究的重要课题,对伤后时间的推断也是备受法医学界的关注。细胞核因子(NF-κ B)广泛存在于各类细胞中,在机体感染,创伤后的免疫,炎症及细胞的生长调控过程中发挥着重要的作用,参与多种炎症介质的基因转录调控,且在机体创伤早期即有表达。本研究通过建立大鼠脑挫伤模型,应用免疫组化SABC法,从蛋白分子水平研究大鼠脑挫伤后不同时间NF-κ B表达与损伤经过时间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 64只健康成年 Wistar大鼠,雌雄不限,体重250 g±10 g,由山西医科大学实验动物中心提供,随机分为实验组(56只)与对照组(8只),实验组根据损伤时间的不同分成7个小组,即挫伤后1 h组、4 h组、12 h组、48 h组、72 h组、7 d组、14 d组,每组 8只。

1.2 动物模型制备 实验组动物参照Feeney's法建立大鼠脑挫伤模型。大鼠称重后,3%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉,大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部,正中切开顶部头皮,在人字缝前方3 mm、颅骨中线旁3 mm处,钻直径5 mm的圆形骨窗。保持硬膜完整,采用自由落体打击装置,以40 g重锤从20 cm高处下落打击。术后动物常规进食饮食。在各分组时间点处死大鼠,4%多聚甲醛心脏灌流后取脑组织。对照组依上述方法钻孔后直接处死后4%多聚甲醛心脏灌流。

1.3 免疫组织化学染色 将固定好的脑组织用蔗糖PBS液梯度脱水后,用LEICA CM1850超薄切片机在损伤部位范围内作连续冰冻切片(厚度为 5 μ m)。一抗为兔抗鼠 NF-κ B单克隆抗体(购于武汉博士德生物工程公司),工作浓度为1∶200,用PBS替代一抗作为阴性对照,免疫组织化学染色试剂盒为武汉博士德生物工程公司(货号SA1022),染色步骤按说明书进行操作。DAB(武汉博士德生物工程公司)显色,苏木素复染,酒精脱水、透明、封片,显微镜观察并拍照。

1.4 图像分析与统计学处理 运用BI-2000图像分析系统,在脑挫伤区周围随机选取5个高倍视野(×400),以损伤部位周围出现棕色颗粒为阳性反应,进行NF-κ B免疫组化染色阳性细胞记数。采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间差异比较采用t检验和方差分析。

2 结 果

2.1 免疫组化染色观察 损伤后1 h在挫伤区即可见极少量NF-κ B表达的阳性细胞,棕色颗粒分布于细胞核周围及胞浆,呈圆形或椭圆形;损伤后4 h可见大量阳性细胞较1 h增多;损伤后12 h损伤局部的免疫阳性反应较伤后4 h明显增强,棕黄色颗粒增多,呈丛状或簇状聚集,染色加深,免疫反应范围增大达到高峰;损伤后 48 h～72 h NF-κ B表达阳性细胞计数逐渐减少且染色变淡,范围也逐渐缩小;7 d时仍可见少量阳性颗粒表达,直至损伤后14 d基本恢复至正常水平。

2.2 NF-κ B表达的阳性细胞免疫组化染色图像分析结果大鼠脑挫伤后1 h NF-κ B表达即开始逐渐增多且随着脑损伤后时间的延长呈上升趋势,12 h达到高峰,随后随着时间的延长而逐渐减少,直到14d时仍有表达且高于对照组。除14 d组外,其余各实验组与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 脑挫伤后NF-κ B阳性细胞计数(±s)个

表1 脑挫伤后NF-κ B阳性细胞计数(±s)个

组别 鼠数(只)阳性细胞数对照组 8 4.25±0.14 1 h组 8 22.15±2.701)2)4 h组 8 51.20±4.521)12 h组 8 58.61±1.671)48 h组 8 29.22±1.591)2)72 h组 8 20.10±2.461)2)7 d组 8 17.11±2.841)14 d组 8 6.10±0.542)与对照组比较,1)P＜0.05;与上组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

核转录因子是1986年由Bltimore和Rwiansen发现的。他们在成熟B细胞和浆细胞中发现这种蛋白能与免疫球蛋白κ轻链内含增强子的特异性序列结合,故而命名NF-κ B。事实上,在后来的研究证实它在机体的所有细胞中存在,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族,目前发现在哺乳动物细胞中最常见中主要有 p65(RelA),p50/p105(NF-κ B1)[1]。本实验选取亚基p65为研究目标。

NF-κ B二聚体与其抑制蛋白IkB结合成三聚体以无活性的形式存在于细胞中。在细胞受刺激后,由信号诱导激活IkB激酶(IkBkinase,IKK)使制蛋白IkB脱磷酸化。IkB激酶是NF-κ B活化的主要限速酶,IKK的活性与NF-κ B活性密切相关,IKK的活性有微小下降会引起IkB降解大幅减少,导致NF-κ B活性降低。抑制蛋白IkB脱磷酸化与降解使NF-κ B暴露出核定位信号(nuclear localization singal,NLS),进而介导位于胞浆的NF-κ B通过核孔复合物进入核内后才参与多种基因的转录调控[2,3]。此激活过程可在细胞受刺激后数分钟内完成。激活细胞内NF-κ B有细胞因子、神经递质、神经生长因子等。本实验观察到NF-κ B的表达水平:阳性细胞以大脑皮质、杏仁核、海马等部位为著。损伤后1 h即有NF-κ B蛋白表达阳性细胞出现,4 h后表达明显增多,12 h达到高峰,在48 h后逐渐减少,7 d时仍有一定量细胞高于对照组,14 d后基本恢复至接近对照组水平。除14 d组外其余不同时间段神经元NF-κ B阳性细胞数量与对照组之比较均有明显差异。这表明损伤后NF-κ B表达可快速上升,并在12 h～48 h内达到峰值,7 d以后接近至正常水平。脑挫伤后NF-κ B可作为一种快速反应性蛋白诱导而增高,亦参与对损伤的神经元进行修复和保护作用[4,5]。因为NF-κ B预先存在于胞浆中,在处于应激状态下就可以不用合成新的蛋白立即参与调节和应激反应有关的基因表达。多种致炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)等作为NF-κ B的激活物活化细胞浆内的NF-κ B后,诱导TNF-α、IL-1等的基因转录,使 TNF-α、IL-1的表达和释放增多,而后两者又可使 NF-κ B活化,如此往复产生级联放大效应。因此大鼠脑挫伤后短时间内NF-κ B即可迅速上升而达高峰。本实验结果所显示的NF-κ B表达呈现的时序性与国内外研究报道相一致。

NF-κ B表达在脑挫伤后短时间内迅速升高,经历了一个先逐渐增加到峰值后又恢复到接近正常水平的过程。其表达规律与损伤时间有一定的相关性,尤其是在脑损伤后48 h内达到最高峰。在最近几年里,很多学者对NF-κ B进行大量的研究,以期利用它表达规律的时序性作为脑损伤时间推断的指标之一,但目前在脑损伤12 h内仍没有取得突破性进展。本实验局限于动物实验,且样本量有限,因而 NF-κ B成为今后临床法医学推断早期脑损伤时间的客观指标还得进一步研究。

[1]唐群,熊平,金秀文.核转录因子-κ B及其在创伤性脑损伤后的作用[J].中国核医学杂志,2006,21(1):42-44.

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