尼古丁对血管内皮细胞PAI-1表达水平的影响

杜 艳,韩葆芬,胡晓芸

纤溶系统的功能下降与血栓性疾病密切相关,纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)是纤溶系统的一个重要调节因子,高水平的PAI-1抑制纤溶系统的活性,参与血栓性疾病的发生发展过程。尼古丁作为香烟烟雾中的有害物质之一,不仅可以活化炎性细胞,调控细胞凋亡,而且可以损伤血管内皮,导致内皮细胞功能障碍,是血栓形成的重要危险因素。本研究采用尼古丁干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察尼古丁对PAI-1在蛋白及基因水平表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 HUVECs细胞株购自上海门谍塔生物科技发展有限公司。尼古丁购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;RPMI-1640培养基、胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。PAI-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海太阳生物技术公司;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;T rizolRNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 HUVECs的培养与分组 HUVECs用含10%FBS的RPMI-1640培养液,在 37℃、5%CO2箱中培养,隔日换液 1次,待细胞生长至亚融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2传代,接种于25 cm2培养瓶中,倒置显微镜下观察可见细胞呈多角形或“铺路石”样排列,待 HUVECs达80%融合后随机分为对照组与尼古丁组。对照组培养液中不加任何干预;尼古丁组于培养液中加入一定体积的尼古丁,使其终浓度为100 μ mol/L。相同实验条件孵育12 h,收集各组细胞及上清液用于PAI-1mRNA及蛋白的检测。

1.3 PAI-1蛋白的测定 采用ELISA法对各组细胞上清液进行测定。实验操作严格按试剂盒说明步骤进行。

1.4 RT-PCR检测PAI-1 mRNA表达 按 Triol试剂盒说明提取细胞总 RNA。按转录试剂盒取6 μ L的总RNA逆转录为相应的cDNA。再取逆转录产物5 μ L进行 PCR的扩增反应,PAI-1引物序列:上游5'-TGCCCTCTACTTCAACGG-3',下游5'-GTCGGTCATTCCCAGGTT-3',扩增产物片断 390bp。GAPDH 引 物 序列:上 游 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3',下游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',扩增产物片断307bp。PCR循环条件:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共反应32个循环。取PCR扩增产物10 μ L,在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,用凝胶成像系统对电泳条带进行吸光度(A)值的半定量分析。以PAI-1/GAPDH mRNA吸光度比值来表示PAI-1mRNA的表达水平。

1.5 统计学处理 经SPSS 13.0软件包进行统计分析,数据以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HUVECs形态观察 在倒置相差显微镜下观察HUVECs,可见其形态不规则,呈扁平、椭圆形、梭形或多角形,为单层鹅卵石状镶嵌排列,细胞单层融合时呈典型的“铺路石”样外观。

2.2 尼古丁对HUVECs PAI-1mRNA表达的影响 总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离可见28 s和18 s两条清晰的条带,表明RNA保持较好的分子完整性。PAI-1与GAPDH的PCR产物经电泳分离后,与Marker比较在100bp～500bp之间可见两条分子量大小不同的特异性条带,与预期长度相吻合,说明为特异性扩增片段,GAPDH产物光密度值基本一致(见图1)。尼古丁组 PAI-1mRNA(1.321±0.198)显著增高,与对照组(0.729±0.100)比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 尼古丁作用 HUVECs后PAI-1mRNA表达电泳图

2.3 尼古丁对HUVECs PAI-1蛋白表达的影响 尼古丁组PAI-1蛋白表达与PAI-1 mRNA的变化一致,尼古丁组PAI-1蛋白为(21.084±0.829)ng/mL,对照组为(13.388±0.927)ng/mL,尼古丁组较对照组显著升高(P＜0.01)。

3 讨 论

正常血管内皮在维持凝血和纤溶系统功能上发挥重要作用,血管内皮的受损,导致凝血功能亢进,纤溶系统失活,与多种血栓性疾病的发生密切相关。大量的研究表明,吸烟是血栓性疾病发生的重要危险因素。香烟烟雾的主要有害成分尼古丁不但能引起炎性细胞的活化,调控细胞的凋亡,还能够损伤血管内皮,导致内皮细胞功能紊乱,在血栓性疾病中起着关键作用。

PAI-1属丝氨酸蛋白酶抑制物家族,是一种分子量约为50 kD的单链糖蛋白,是纤溶受损和血栓形成的标志物[1]。其功能为灭活组织型纤溶酶原活化物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原活化物(u-PA),从而对机体的纤溶系统活性起到重要的调节作用。PAI-1在纤溶系统中起着决定性作用,其活性和水平的高低决定着纤溶系统活性的高低。本实验的前期研究表明,以不同浓度的尼古丁干预HUVECs后,各尼古丁组PAI-1含量均增高,但仅100 μ mol/L尼古丁组与对照组比较有统计学意义;再以100μ mol/L尼古丁干预HUVECs,分别孵育0 h、4 h、6 h、8 h、12 h和 24 h后,可见随着时间的延长,上清液的PAI-1含量逐渐增高,并于12 h达到高峰,提示尼古丁在一定范围内呈浓度和时间依赖性上调PAI-1的表达,对血管内皮的纤溶功能具有抑制作用,且引起变化的最佳尼古丁浓度是 100 μ mol/L,最佳作用时间是12 h。本实验在此基础上进一步对100 μ mol/L尼古丁作用于HUVECs12 h后的细胞PAI-1 mRNA进行检测,结果显示,尼古丁不仅可以引起HUVECs上清液中PAI-1蛋白的高表达,同时上调了PAI-1mRNA基因的转录水平,PAI-1蛋白和基因的表达一致,提示尼古丁在基因水平上诱导PAI-1的表达,进而调控蛋白的分泌,高水平的PAI-1引起t-PA/PAI-1mRNA和蛋白比值的下调而抑制了纤溶系统的活性。而多种炎症因子如脂多糖、白细胞介素-1、肿瘤坏死因子、凝血酶和纤维蛋白原也可促进PAI-1的分泌[2,3]。作为对纤溶系统起决定作用的PAI-1,其在血浆中的水平及活性,既受许多环境因素的影响,又受机体遗传基因决定,确切机制尚不清楚。近年来研究提示PAI-1基因启动子区域转录起始点上游-675bp处,由于单个鸟嘌呤的插入或缺失形成了4个鸟嘌呤碱基序列(4G)或 5个鸟嘌呤碱基序列(5G)的多态性改变[4],可明显影响PAI-1活性及水平[5]。

PAI-1基因4G/5G多态性与PAI-1的表达水平明显相关:4G/4G基因型的PAI-1血浆活性水平最高,4G/5G基因型居中,5G/5G基因型最低。Brown等[6,7]也认为PAI-1(4G/4G)纯合子的血浆PAI-1显著升高,PAI-1基因型影响PAI-1的基础浓度,也影响PAI-1受诱导后的浓度。

本研究结果表明尼古丁通过损伤血管内皮细胞导致PAI-1水平的升高,而PAI-1基因4G/5G的多态性与尼古丁诱发的PAI-1的高水平转录继而导致血栓性疾病的发生是否呈正相关,这有待于进一步的实验进行验证。因此,深入研究PAI-1基因的多态性与血栓性疾病的关系,对进一步阐明尼古丁所致血栓性疾病的发病机制具有一定意义。

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