三氧化二砷对鸡马立克病病毒诱导鸡肝脏肿瘤中血管生长相关因子表达的影响

李金龙,国 琳,刘晓瑛,张久丽,3,孙 刚,徐世文

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨150030;2.浙江省余姚市畜牧兽医局,浙江余姚315400;3.黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江 双城150100;4.黑龙江省动物卫生监督所,黑龙江哈尔滨150090)

鸡马立克病(MD)是世界上第一个能用疫苗成功预防的肿瘤性疾病,因此在肿瘤发生和抗肿瘤治疗方面的研究中,MD是一种理想的肿瘤模型[1]。三氧化二砷(As2O3)主要是通过抑制鸡MD肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡起抗肿瘤作用[2-3],近年人们又发现As2O3可以通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤的效果。因此,研究肿瘤血管形成为探寻肝脏肿瘤的治疗提供了新策略,但关于As2O3对MDV诱导的鸡肝脏肿瘤中血管生长影响的研究未见报道。本研究旨在揭示MD鸡肝脏肿瘤中血管内皮细胞生长因子表达情况和As2O3对其影响,探讨As2O3抑制MD鸡肝脏肿瘤生长的机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物与处理 1日龄伊莎公鸡500只(东北农业大学孵化场),随机分为对照组100只、攻毒组与攻毒加砷组各200只,按常规进行免疫接种(攻毒组与攻毒加砷组不接种马立克疫苗),隔离饲养,自由采食。对照组,常规饲养;攻毒组与攻毒加砷组在第1天腹腔注射用 Hank's液10倍稀释的SPF雏鸡复壮的MDV京-1株(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长军研究员惠赠)新鲜血毒,剂量为0.2 mL/羽。饲养30 d后,攻毒加砷组,每两日腹腔注射As2O33.0 mg/kg体重,对照组和攻毒组注射等量生理盐水,连续观察试验组鸡的临床表现并记录。分别于第35、40、45天剖杀试验鸡,进行检测。

1.2 主要试剂 As2O3注射液(1 mg/mL)由本研究室制备,rTaq DNA聚合酶等PCR反应试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司,T rizol试剂盒、MMLV反转录酶购自Invitrogen公司。

1.3 临床观察及血管组织病理学检查 记录各试验组鸡的临床症状,观察病理剖检变化,按常规法取对照组肝脏和试验组肝脏肿瘤组织,固定,制片,H.E.染色观察。

1.4 鸡肝脏及肿瘤组织中血管生长相关因子VEGF、KDR及bFGF mRNA表达的检测 根据GenBank上VEGF基因序列(序列号AB011078)、KDR基因序列(序列号AY382882)、bFGF基因序列(序列号NM205433)与β-actin基因序列(序列号NM205518),应用Oligo 6.0软件设计引物,由上海英骏生物技术有限公司合成。VEGF引物(PCR产物 长 度 458bp)上 游:5′-GATGAGATGTGCGGGT TGC-3′, 下 游 :5′-AAATCAGGCTCCAGAAACAG-3′;KDR引物(PCR产物长度428 bp)上 游:5′-GAGTCATAGGCAACGACAC-3′,下游:5′-CAGCTCAACTTGGTAGTG-3′;bFGF 引 物(PCR 产 物 长 度 233bp)上 游:5′-TTCAAGCAGAAGAAAGAGGAG-3′, 下 游:5′-AGGTCCAGTTTTTGGTCCG-3′;β-actin 引物(PCR 产物长度282 bp)上游:5′-ACG TCGCACTGGATT TCGAG-3′下游 :5′-TGTCAGCAATGCCAGGGTAC-3′

应用Trizol试剂盒提取肝脏及肿瘤组织总RNA,并测定 RNA浓度及纯度。取总 RNA 5.0 μ g,以加寡脱氧胸苷(Oligo(dT))为引物进行反转录反应。取反转录产物2 μ L,进行 50 μ L 反应体系PCR扩增。扩增条件为:预变性95℃5 min,变性95℃1 min,退火 58.5℃(VEGF)、54℃(KDR、bFGF与β-actin)、45s,延伸 72℃1 min,30个循环,72℃终延伸 7 min。分别以 VEGF、KDR及bFGF基因与β-actin基因的PCR产物的灰度比值来表示基因mRNA的相对表达水平。

1.5 试验数据的分析与统计 数据的统计学分析应用SAS软件与Microsoft Excel 2 000对试验数据进行统计并作图。

2 结果

2.1 临床症状观察及血管组织病理学变化 对照组鸡无异常。攻毒组鸡表现出MD典型症状,如“劈叉”现象,剖检可见肝脏表面有灰白色粟粒至绿豆大不等的病灶(见图1,图2)。攻毒组加砷组鸡注射As2O3后,随着时间的延长症状逐渐减轻,剖检可见肝脏肿瘤出现明显减少,生成的肿瘤也有明显减小。

组织学检查对照组肝脏结构正常。攻毒组病鸡肝脏小叶间结缔组织中见界限模糊的结节性增生,其周围血管丰富,有大量血管上皮细胞,肝窦中有部分的弥散性浸润(见图3)。攻毒组加砷组病鸡肝脏中可见灶状瘤细胞团,周围细胞有空泡变,汇管区扩大,周围血管数量明显减少,血管上皮细胞脱落、变性,个别出现细胞坏死,周围结缔组织有纤维化(见图4)。

2.2 鸡肝脏及肿瘤组织中VEGF与KDR mRNA表达的检测结果 见表1。

由表1可知,攻毒加砷组肝脏肿瘤组织内VEGF mRNA表达水平随时间的延长逐渐降低,与同一时间段对照组比较,各组间均差异极显著(P＜0.01),与同一时间段攻毒组比较,45 d组差异极显著(P＜0.01)。攻毒加砷组肝脏肿瘤内KDR mRNA的表达水平随时间的延长逐渐降低,与同一时间段对照组比较,35 d组间差异极显著(P＜0.01);与同一时间段攻毒组比较,40 d和45 d组差异极显著(P＜0.01);攻毒加砷组间比较,35 d与40 d和45 d组间差异极显著(P＜0.01)。

表1 鸡肝脏及肿瘤内VEGF与KDR mRNA表达水平的检测结果

2.3 鸡肝脏及肿瘤组织中bFGF mRNA表达的检测结果 见表2。

由表 2可知,攻毒加砷组肝脏肿瘤内 bFGF mRNA的表达水平随时间的延长逐渐降低,与同一时间段对照组比较,各组间差异极显著(P＜0.01);与同一时间段攻毒组相比,40 d和45 d组间差异极显著(P＜0.01);攻毒加砷组间比较,各组间差异极显著(P＜0.01)。

表2 鸡肝脏及肿瘤内bFGFmRNA表达水平的检测结果[IOD(bFGF)/IOD(β-actin)]

3 讨论

研究表明VEGF及其受体(VEGFR)在肝脏肿瘤组织中较正常肝组织呈过高表达,与肝脏肿瘤的生长、转移、复发及治疗密切相关[4]。As2O3能够抑制乳腺肿瘤细胞内VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达,且随 As2O3浓度的增加其抑制作用更明显[5]。Roboz G J等[6]证实As2O3可直接诱导血管内皮细胞和白血病细胞凋亡,使VEGF表达减少,抑制肿瘤的新生血管生成。bFGF是最重要的多肽类生长因子之一,作为一种强有力的促血管生成剂,具有促进肿瘤细胞转化为血管生成表型的能力,其在肿瘤发生、发展及转移中发挥重要作用。Woo S H等[7]研究发现,As2O3能够明显的抑制bFGF、VEGF刺激的人脐静脉上皮细胞增殖,并有剂量依赖性。

本试验结果表明,MD病鸡肝脏肿瘤内VEGF、KDR及bFGF mRNA的表达水平显著高于正常肝脏组织,As2O3能够下调肿瘤组织内VEGF、KDR与bFGF mRNA的表达水平,并呈现时间效应;而MD病鸡腹腔注射As2O3后,临床症状减轻,肝脏肿瘤数量和大小明显较少,肿瘤组织周围血管数量明显减少,血管上皮细胞脱落、变性,个别出现坏死。揭示As2O3能够通过下调肝脏肿瘤组织中VEGF、KDR与bFGF mRNA的表达水平,破坏血管内皮细胞的结构和功能,抑制肿瘤细胞转化为血管生成表型,从而直接抑制肿瘤血管的新生,减少肿瘤的营养供给,对肿瘤的生长起到控制作用,这是As2O3抗肿瘤作用机制之一。

[1]Burgess S C,Young J R,Baaten B J,et al.M arek′s disease is a natural model for lymphomas overexpressing Hodgkin′s disease antigen(CD30)[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(38):13879-13884.

[2]张久丽,王金涛,肖银霞,等.三氧化二砷诱导鸡M D肿瘤细胞凋亡及对细胞内钙离子浓度的影响[J].中国家禽,2008,30(10):21-24.

[3]张久丽,李忠显,吴立君,等.三氧化二砷对鸡马立克氏病肿瘤细胞凋亡的影响[J].中国兽医科学,2008,38(2):137-141.

[4]Fayettw J,Soria J C,Armand J P.T argeting angiogenesis in oncology[J].Pathol Biol(Paris),2006,54(4):199-205.

[5]赵增虎,张建宇,刘秀芳,等.T ACE对原发性肝癌 VEGF和M VD的影响[J].中国误诊学杂志,2007,7(4):717-718.

[6]Roboz G J,Dias S,Lam G,et al.Arsenic trioxide induces dose-and time-dependent apoptosis of endothelium and may exert an antileukemic effectviainhibition of angiogenesis[J].Blood,2000,96(4):1525-1530.

[7]Woo S H,Park M J,An S,et al.Diarsenic and tetraarsenic oxide inhibit cell cycle progression and bFGF-and VEGF-induced proliferation of human endothelial cells[J].J Cell Biochem,2005,95(1):120-130.