实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立与应用

张太翔,凌宗帅,史玉颖,高小博,田国宁,张金玲,韩 亮,张丽萍

(1.潍坊出入境检验检疫局,山东潍坊261041; 2.济南出入境检验检疫局,山东 济南250010;3.山东省农业科学院家禽研究所,山东济南250023; 4.北京盈九思科技发展有限公司,北京朝阳100029)

禽白血病是由反转录病毒科禽白血病病毒和肉瘤病毒群中的病毒引起的鸡的各种可传播的良性和恶性肿瘤。根据在不同遗传型鸡胚成纤维细胞上的宿主范围、与相同或不同亚群成员的干扰模式以及病毒囊膜抗原分为 A、B、C、D、E和 J6个亚群。该病具有水平传播和垂直传播两种特性,并以垂直传播为主,且还存在内源性病毒[1-2]。荧光定量PCR技术以其灵敏度高、特异性好、快速、准确等优点,在病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。本文针对ALV的保守序列LTR设计引物和探针,建立了ALV的实时荧光定量 RT-PCR检测方法,为快速诊断和监测禽白血病提供了一种新的快速有力的手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 1 材料 病毒材料为实验室保存的2002年～2008年分离的不同的ALV毒株,分别为 ALV-1-2002,ALV-3-2003,ALV-1-2005,ALV-4-2008。用于特异性分析的新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性囊病病毒(IBD)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和马立克病病毒(MDV)均由实验室保存,Taq DNA聚合酶、MMLV逆转录酶、dNTPs、质粒纯化试剂盒购自美国Promega公司,pEASY-T载体购自全式金生物技术有限公司,T rizol购自美国Invitrogen公司,ALV抗原ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.1.2 仪器 美国ABI公司的7500型荧光定量PCR仪、德国 EPPENDORF公司5810R、5417冷冻离心机、法国VILBER公司的凝胶成像系统、德国EPPENDORF公司的蛋白核酸分析系统等。

1.2 引物和探针的设计 选取ALV病毒的LT R序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针序列如下:

引物 ALV-F1:5′-AGACCAAATAAGGAAAAAGCAAGA-3′;

引物 ALV-R1:5′-ATAATCGTACATAGCT T CGTCTAC-3′;

探针 :5′-CGTCAT TCCTTCCTTATCTAGTCGC CAC-3′

探针的5′端标记 FAM 荧光基团,3′端标记BHQ-1,由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3 标准阳性对照的制备 本试验所用的标准阳性对照为实验室构建的含有ALV LTR序列的质粒。将引物ALV-F1和ALV-R1扩增的PCR产物克隆到载体pEASY-T上,采用PCR验证阳性克隆,然后再进行测序,命名为pEASY-ALV。然后将经验证的阳性克隆用 LB培养基(含100μ g/mL氨苄青霉素)增殖[3],采用质粒纯化试剂盒提取质粒DNA。用核酸分析仪测定质粒DNA的OD260,按照文献[4]方法计算其拷贝数,作为标准阳性样品。

1.4 组织RNA的提取 取鸡的肾、脾、脑等组织,混合再进行匀浆,采用Invitrogen公司的T rizol提取核酸,按照说明书进行病毒RNA的提取。

1.5 实时荧光定量 RT-PCR反应 5 μ L 5×RTPCR mix(包含Taq DNA polymerase,M-MLV逆转录酶,dNTPs和MgCl2等 RT-PCR反应成分),0.25 μ mol/L ALV-F1,0.25 μ mol/L ALV-R1,0.25 μ mol/L 探针和 ALV 模板 ,补充水至 25 μ L。PCR反应参数如下:42℃30 min,95℃10 min,95℃10 s,60℃1 min,在60℃采集荧光,进行 40个循环。

1.6 ALV实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度和特异性 ALV质粒 DNA以3.0×102～3.0×107系列稀释,进行实时荧光定量RT-PCR,每个稀释度做两个平行。测定该方法的检测灵敏度,并绘制标准曲线。分别提取ALV不同分离株、新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、马立克病病毒的核酸,测定该方法的特异性。

1.7 数据分析 荧光RT-PCR反应结束后,利用SDS 1.2软件进行数据分析,根据标准曲线可以得出待检样品中的病毒含量。

1.8 临床样品的检测 送检的90个有生长发育不良,胸腺、腔上囊萎缩等临床症状的鸡的泄殖腔棉拭子样品,采用实时荧光定量RT-PCR方法和ELISA抗原检测试剂盒进行检测。

2 结果

2.1 定量PCR反应检测ALV的灵敏度试验 将质粒pESAY-ALV的进行10倍系列稀释,每个稀释度做两个平行,进行 ALV实时荧光定量 RTPCR检测。图1 A表示质粒pEASY-ALV各个稀释度的扩增曲线。其中 X轴代表PCR反应循环数,Y轴Rn代表荧光信号强度。可以看出,质粒浓度为3.0×102～3.0×107个拷贝6个数量级的范围内定量 RT-PCR有“S”型扩增曲线,即反映了PCR的指数增长期,线性增长期和平台期3个阶段。进一步分析扩增曲线,发现指数增长期的曲线平行,反映了PCR的扩增效率相近;而不同稀释度之间的Ct相差均匀,符合定量PCR的Ct值与起始拷贝数之间严格的线性关系。每个稀释度的两个重复,其扩增曲线基本吻合在一起,反映了试验的平行性好。根据质粒拷贝数与Ct值的相关性,由SDS2.1软件得到标准曲线,见图1 B。横坐标代表质粒拷贝数(X),纵坐标为 Ct值。标准曲线方程:Y=3.12X+39.6,相关系数R2=0.997。标准曲线在3.0×107～3.0×102拷贝范围内呈现良好的线性关系,检测下限为30个拷贝。

2.2 ALV实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性试验 提取 ALV不同分离株以及新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡传染性贫血病毒和马立克病病毒的核酸,进行ALV实时荧光定量RT-PCR检测其特异性,扩增曲线见图2。可以看出,ALV不同分离株扩增曲线呈“S”型,而新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡传染性贫血病毒和马立克病病毒的没有典型的“S”型扩增曲线,表明没有发生扩增反应,结果显示建立的ALV实时荧光定量RT-PCR检测方法具有很好的特异性。

图1 ALV实时荧光定量RT-PCR的灵敏度检测图

图2 ALV特异性试验的荧光定量RT-PCR的扩增曲线图

2.3 实时荧光定量RT-PCR反应检测待检样品中的ALV 用建立的定量RT-PCR反应方法检测90个待检的鸡的泄殖腔棉拭子样品。在检测过程中,以ALV RNA、健康鸡组织RNA为模板,分别作为阳性对照、阴性对照。排除假阳性和假阴性结果。定量PCR结果表明,阳性对照有“S”型扩增曲线,空白对照和阴性对照无明显的“S”型扩增曲线,且荧光信号值低。表明试验过程符合质量控制的要求,可以排除假阳性和假阴性结果。定量RT-PCR检测发现,有56个鸡的泄殖腔棉拭子样品有“S”型扩增曲线,且荧光信号值高,可判断其含有ALV病毒,扩增曲线见图3,检出率为 56/90,而ELISA方法检出率为51/90,二者结果基本吻合。

3 讨论

图3 临床样本中ALV实时荧光定量RT-PCR的扩增曲线图

禽白血病给我国的养禽业造成巨大的经济损失,特别是对蛋种鸡等的影响巨大,淘汰率很高。目前本病没有有效的治疗办法和有效的药物和疫苗预防。因此建立快速、特异和高通量的检测方法是预防和控制本病首要之选[5-6]。本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病的方法,特异性好,只从禽白血病阳性病料中检测到特异性的扩增信号,不与检测的其他常见家禽传染病发生特异性反应;对禽白血病的检测灵敏度为30个拷贝/反应,灵敏度高;检测量大,一次可以检测90份样品,整个反应都在密闭的系统内进行,避免了样品间的污染;检测速度快,从样品处理包括RNA的提取,PCR等到试验结束,大约需要4个小时的时间,比其他的血清学检测方法节省了时间;准确性高,Taq Man探针只与特异性的模板发生反应,假阳性率低,与Sybr Green染料相比,不需要考虑引物二聚体和其他非特异性扩增[7-8]。

本文结合ABI 7500荧光检测系统,建立了Taq Man探针实时定量RT-PCR法快速、准确检测家禽中的ALV。反应体系包括一对引物和一条探针(长度为都为19 bp),探针5′端标记荧光报告基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针完整时,两基团在空间结构上距离相互靠近,5′端报告基团产生的荧光被3′端淬灭基团淬灭,故体系中没有荧光信号的产生。在PCR退火和延伸过程中,探针与模板特异性结合,随着引物的延伸,Taq DNA聚合酶利用其5′-3′端外切酶活性,对探针进行切割,报告基团远离淬灭基团,报告基团所释放的荧光可以被检测,荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系,可以达到定量检测的目的。

本文建立的ALV的检测体系中,引物和探针只与ALV核酸特异性地结合,与其他的家禽传染病的核酸都没有反应,表明引物和探针的特异性较好。标准曲线在3.0×102～3.0×107拷贝范围内呈现良好的线性关系,检测下限为30个拷贝。定量PCR仅需要2 h操作,一次可以进行96个样品的检测,PCR反应结束后可立即观察结果,不需要电泳、染色,因此更方便、快速。

本研究建立的方法不仅克服了禽白血病病毒分离的费时费力的缺点,减少了检测时间,节省了大量的人力和财力。不仅能用于养殖场中禽白血病的快速检测,为鸡场减少损失,而且还可以用于家禽和禽肉产品中禽白血病的快速检测,为进出口检验检疫提供可靠的检测方法。

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