狂犬病街毒的分离与鉴定

马 君,王 栋,于康震,汪 明

(1.中国农业大学动物医学院农业部人畜共患病重点开放实验室,北京海淀100193;2.北京海淀中海动物保健科技公司,北京海淀100081;3.中国兽医药品监察所,北京海淀100081)

本课题组自2004年开始动物狂犬病灭活疫苗(FLury LEP株)的研制,在对疫苗进行评价的过程中,对一份来自广西的狂犬病病犬脑组织进行了鉴定,旨在为疫苗的本动物攻毒试验提供适宜的攻击毒株,并为我国狂犬病分子流行病学研究提供依据。鉴定结果如下。

1 材料与方法

1.1 病毒和血清 疑似狂犬病病犬脑组织,由广西动物疫病预防控制中心提供;狂犬病病毒 Flury LEP株和狂犬病阳性血清,由中国兽医药品监察所提供;犬瘟热病毒(CDV)JL株,由中国农业大学刘维全教授提供;犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒1型(CAV-1)、2型(CAV-2)和犬冠状病毒(CCV),由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。

1.2 主要仪器设备及试剂 生物安全柜(德国Heraeus公司);PCR仪,BIO-RAD公司;DNA标准参照物DL-2 000和DL-5 000(北京全式金生物技术有限公司);DNA和RNA提取试剂盒及PCR试剂盒(天泽基因工程有限公司);FITC抗狂犬病病毒荧光单抗(Fujirebio Diognostics公司);狂犬病脑组织荧光染色标准阳性抹片,由军事医学科学院军事兽医研究所狂犬病及野生动物与人兽共患病诊断实验室提供,阴性抹片由本实验室制备;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验动物 3日龄乳鼠及体重11～13 g清洁级昆明系小鼠、4月龄比格犬,购自北京实验动物中心。

1.4 病毒分离及传代 取狂犬病病犬脑组织,加PBS研磨,制成20%(W/V)乳剂,经除菌处理后,脑内接种乳鼠,0.03 mL/只。无菌采集接种后5～7 d濒死乳鼠脑组织,制成20%(W/V)乳剂,连续传3代,分别标记为F1、F2和F3。

1.5 电镜观察 用附有Formvar膜的铜网沾取犬脑组织及F3代鼠脑组织乳剂,用滤纸吸去多余液体,经2%磷钨酸染色 1 min,用滤纸吸去染液,晾干后进行电镜观察。

1.6 中和试验 取3代鼠脑组织乳剂,分别用PBS稀释至10-2,与等量狂犬病阳性血清混匀,同时设未中和的病毒作对照。置37℃中和1 h后,分别脑内注射11～13 g小鼠10只,0.03 mL/只,观察14 d,记录小鼠发病死亡情况。

1.7 病毒含量测定 取3代鼠脑组织乳剂分别按现行《中国兽药典》附录进行检测[1]。

1.8 本动物回归试验 取F3代乳剂肌肉注射狂犬病抗体阴性的比格犬8只,4.0 mL/只,观察30 d,记录犬发病、死亡情况。并取死亡犬脑组织进行直接荧光抗体染色(dFA)[2]。

1.9 N基因保守序列的扩增与分析 根据军事医学科学院军事兽医研究所提供的序列合成引物,RV-P1:5′-ATGTAACNCCTCTACAATGG-3′,RV-P2:5′-GCCCTGGT TCGAACA TTCT-3′,预期扩增片段大小为845 bp。按试剂盒说明书提取RNA,RT-PCR参照《分子克隆》[3]进行。对RTPCR产物进行序列测定,并采用DNAStar软件,与GenBank发表的狂犬病病毒 CVS-11株、PV株、Flury LEP株以及ERA株的N基因进行比较。

1.10 分离株的纯净检验 按现行《中国兽药典》[1]附录进行细菌、真菌和支原体检验。采用 PCR或RT-PCR进行外源病毒的检验。其中根据刘维全教授提供的引物序列,合成了扩增犬瘟热H蛋白基因保 守 序 列 的 引 物,CDV-P1:5′-CCTGGCCTCTGAGAAACAAG-3′;CDV-P2:5′-GAGTTCA AAAG TGG GCTTTC-3′,预期扩增片段大小为 224 bp。CPV、CAV-1、CAV-2和CCV检验的特异性引物均由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供,分别扩增CPV的 VP2、CAV-1和CAV-2的 E3蛋白以及CCV的S蛋白基因保守序列,预期扩增片段大小分别为801 bp、520 bp、1 030 bp和372 bp。

2 结果

2.1 病毒分离 将狂犬病病犬脑组织经乳鼠脑内连传3代,分离到狂犬病病毒,根据其来源,定名为GXLA(广西隆安)株,每代均于接种后4 d开始发病,至6 d或7 d全部死亡。

2.2 电镜观察 对病犬脑组织和F3代病毒液进行电镜观察,可见子弹状病毒粒子,大小约为70×150 nm,与文献描述[4]基本一致,完整病毒粒子较多,包膜较光滑。

2.3 中和试验 将3代病毒分别与狂犬病阳性血清中和后,注射的小鼠全部(10/10)存活,而对照组小鼠注射后4～6 d内全部发病死亡,表明待检病毒可被狂犬病阳性血清中和。

2.4 病毒含量检测 F1、F2和F3代病毒含量分别为104.0、104.17和 104.33LD50/0.03 mL,其中 F3 代病毒含量较高。

2.5 病毒回归试验 注射F3代病毒的8只犬均于第7天开始发病,出现不同程度的吞咽困难,流涎,脱舌,轻刺激易兴奋,后躯麻痹直至四肢麻痹等狂犬病症状,至第9天全部死亡。取死亡犬脑组织进行dFA染色,均出现与阳性对照抹片一致的直径小于1 μ m的沙粒样狂犬病病毒特异性绿色荧光。

2.6 N基因保守序列的扩增与分析 分离株F1、F2和F3代均扩增出845 bp的条带,与狂犬病病毒Flury LEP株一致。对F3代RT-PCR产物进行序列测定后,采用 DNAStar软件,与GenBank发表的其他狂犬病病毒株进行同源性分析,结果与CVS-11株、PV株、Flury LEP株、ERA株的同源性分别为92.5%、92.5%、92.9%和 98.5%,同源性较高 ,符合狂犬病病毒N基因高度保守的特性,进一步表明分离的病毒为狂犬病病毒,结果见图1。

图1 狂犬病分离株N基因保守序列的扩增与分析

2.7 纯净检验

2.7.1 细菌、真菌和支原体检验 F1、F2和F3代病毒经硫乙醇酸盐培养基(T.G)、酪胨琼脂(G.A)和葡萄糖蛋白胨汤(G.P)培养5 d,均无细菌和真菌生长;经支原体液体培养基和琼脂固体平板培养28 d,均无pH变化和支原体菌落生长。

2.7.2 外源病毒检验 F1、F2和F3代均未扩增出预期条带,而CDV 、CPV 、CAV-1、CAV-2和CCV阳性对照分别扩增出 224 bp、801 bp、520 bp、1 030 bp和372 bp条带,说明待检分离株无以上病毒污染,见图2。

图2 外源病毒检验结果

3 讨论

狂犬病是迄今为止人类惟一病死率高达100%的急性传染病。该病病原为弹状病毒科狂犬病病毒属成员,狂犬病病毒属可分为4个血清型或7个基因型。目前我国分离的狂犬病病毒均为血清1型或基因1型。狂犬病病毒基因组为不分节段的单股负链RNA,由11 928个核苷酸或11 932个核苷酸组成,含有5个大的ORF,编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖 RNA 的RNA多聚酶(L)等5种结构蛋白[5]。由于核蛋白(N)具有高度保守性,因此常将其作为RV遗传演化和分子流行病学研究的目标。在本研究中分离的狂犬病病毒GXLA株与狂犬病病毒CVS-11株、PV株、Flury LEP株、ERA株核蛋白(N)保守序列同源性在92.5%～98.5%,符合狂犬病病毒核蛋白高度保守的特性。

此次从广西隆安分离的狂犬病街毒毒力较强,对犬致死率100%(8/8),是进行狂犬病灭活疫苗免疫攻毒试验的理想毒株。目前我国狂犬病流行严重,以广西、贵州等地多发,且主要由犬引起,因此对狂犬病街毒株的分离鉴定,也有利于进一步开展狂犬病分子流行病学的研究,为我国狂犬病的防控、诊断以及免疫预防提供科学依据。

[1]中国人民共和国兽药典委员会.中国人民共和国兽药典三部(2005年版)[M].北京:中国农业出版社,2006.

[2]OIE.陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)[M].世界动物卫生组织.农业部兽医局/中国动物卫生与流行病学中心译.5版.2004:287-290.

[3]萨姆布卢克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,黎孟枫,译.2版.北京:科学出版社,1992.

[4]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:中国农业出版社,1997.

[5]俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].2版.北京:中国医药科技出版社,2009.