高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定硫酸庆大霉素注射剂中有关物质*

高燕霞，姜建国，张西如

（河北省药品检验所，河北 石家庄 050011）

庆大霉素（gentamycin sulfate）对各种革兰阴性、革兰阳性细菌及各种肠杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属及铜绿假单胞菌等均有良好抗菌作用，临床用其硫酸盐。笔者参考文献[1-3]，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法，对硫酸庆大霉素及有关物质实行了很好地分离，并通过对照品线性方程法对硫酸庆大霉素发酵液中存在的硫酸小诺霉素及硫酸西索米星进行了定量分析。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪；Alltech ELSD 2000ES型检测器。硫酸庆大霉素标准品（含量为638 U/mg），硫酸小诺霉素标准品（含量为577 U/mg），硫酸西索米星标准品（含量为548 U/mg），均由中国药品生物制品检定所提供；硫酸庆大霉素注射剂（国内某药厂）；水为重蒸水，三氟醋酸、甲醇均为国产色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：ApolloC18柱（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相：0.2mol/L三氟醋酸溶液-甲醇（94∶6）；ELSD参数：漂移管温度为110℃，载气流量为2.0 L/min；进样量：20 μL。按上述色谱条件进行试验，西索米星和硫酸庆大霉素C1a，C2，小诺霉素和C2a峰之间的分离度应符合要求。结果见图1。

图1 系统适用性图谱

2.2 溶液制备

精密称取硫酸小诺霉素标准品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含硫酸小诺霉素0.2，0.5，1.0 mg的溶液，即得硫酸小诺霉素对照品溶液。精密称取硫酸西索米星标准品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含硫酸小诺霉素0.1，0.2，0.5 mg的溶液，即得硫酸西索米星对照品溶液。精密称取硫酸庆大霉素注射剂适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含硫酸庆大霉素1.5 mg的溶液，即得供试品溶液。分别精密称取庆大霉素、小诺霉素、西索米星标准品各适量，用流动相制成每1 mL中各含0.2 mg的溶液即得系统适用性试验溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：由于硫酸庆大霉素属发酵产品，发酵液中可能存在硫酸小诺霉素和硫酸西索米星，故采用系统适用性试验进行方法专属性考察。结果西索米星峰、小诺霉素峰、其他有关物质峰与硫酸庆大霉素各组分主峰均达到基线分离。

线性关系考察：取系列质量浓度的硫酸小诺霉素对照品溶液或硫酸西索米星对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（见图2及图3）。以对照品溶液质量浓度对数值与相应主峰面积对数值进行线性回归，得硫酸小诺霉素和硫酸西索米星回归方程logC=0.941 0 ×logA-7.580 2（r=0.999 8）和 logC=0.969 1 ×logA-7.814 7，r=0.999 9）。结果表明，两者的质量浓度在试验的范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

图2 硫酸小诺霉素标准品图谱

图3 硫酸西索米星标准品图谱

重现性试验：取同一批注射剂，按2.2项下方法配制供试品溶液6份，依法测定。结果硫酸庆大霉素C2含量的 RSD为0.6%（n=6）。

2.4 检测限确定

取硫酸小诺霉素标准品配制成一定质量浓度的溶液，从10 μg/mL开始以等比级数稀释成系列质量浓度的对照品溶液，依法注入液相色谱仪，记录色谱图，对照品质量浓度为0.2 μg/mL时信噪比 S/N≈3，按进样20 μL折合计算，最低检出限为40 ng。取硫酸西索米星标准品配制成一定质量浓度的溶液，从10 μg/mL开始以等比级数稀释成系列质量浓度的对照品溶液，分别量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，对照品质量浓度为0.4 μg/mL时信噪比 S/N≈3，按进样20 μL折合计算，最低检出限为80 ng。

2.5 样品中有关物质测定

按2.2项下方法配制硫酸小诺霉素对照品溶液和硫酸西索米星对照品溶液，取上述6种溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，分别计算硫酸小诺霉素标准品和硫酸西索米星标准品质量浓度对数值与相应主峰面积对数值的回归方程，r应不小于0.99；另按2.2项下方法配制供试品溶液，同法测定，色谱图见图4及图5。用回归方程计算供试品溶液中硫酸小诺霉素及硫酸西索米星的含量。结果见表1。

图4 样品有关物质图谱

图5 硫酸庆大霉素标准品图谱

表1 有关物质含量测定结果

3 讨论

选择溶剂时分别考察了水和流动相。由于硫酸庆大霉素、硫酸小诺霉素及硫酸西索米星均易溶于水，纯水既无干扰又较方便，故选择水为溶剂。由于硫酸庆大霉素是由绛红色小单胞菌和棘状小单胞菌发酵产生的氨基苷类抗生素，经分离确证共约有10余种成分，为多组分抗生素，在检测中需分离硫酸庆大霉素主要的4个组分及硫酸小诺霉素、硫酸西索米星等已知组分和多个未知杂质。曾选择0.2 mol/L三氟醋酸溶液-甲醇为流动相，试验了不同比例（92 ∶8，96 ∶4，94 ∶6）和 100%0.2 mol/L 三氟醋酸溶液，结果比例为92∶8时硫酸西索米星与硫酸庆大霉素C1a之间不能呈基线分离，比例为96∶4及100%0.2 mol/L三氟醋酸溶液时硫酸庆大霉素C2a保留时间太长。最终选择比例为94∶6，可有效分离硫酸庆大霉素的4个组分及相关杂质。

根据蒸发光散射检测器的原理，样品质量浓度和检测器响应之间呈指数关系，对数转换后两者可呈线性，其线性方程的截距并不为零，因此在HPLC-ELSD系统中，不宜使用外标法计算含量。文中采用对照品线性方程计算已知杂质，更有效、准确。

硫酸庆大霉素中有4个主要组分，含量测定主要采用管碟法进行检测。管碟法的原理是量反应平行线原理，即标准品与供试品剂量的反应直线是相互平行的。若不平行，则斜率不等，计算结果将产生较大的误差。影响因素主要是标准品与供试品同质性[4]。其中，多组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌活性（增强或拮抗）物质的量与供试品有所不同，则可使量反应直线不平行。硫酸庆大霉素注射剂中4个组分各自的含量，包括其发酵液中含有的小诺霉素、西索米星等其他组分的量，可能与庆大霉素标准品不尽相同，当培养基营养条件低时，不能完全表现出其本身的效价。这也可间接解释近年来采用不同批号、不同厂家的培养基，利用管碟法测定硫酸庆大霉素效价时差异较大的现象。

[1]黄榕珍，修 虹，林依亮.HPLC-ELSD法测定盐酸精氨酸片含量[J].中国药事，2005，19（11）：675-677.

[2]王明娟，成双红，张斗胜.HPLC-ELSD法测定异帕米星含量[J].中国抗生素杂志，2003，28（1）：20.

[3]谢选亮，陈 悦.HPLC-ELSD法测定β-内酰胺类抗生素注射剂中精氨酸的含量[J]. 中国抗生素杂志，2008，33（6）：342-346.

[4]高燕霞，姜建国.两种方法测定硫酸庆大霉素颗粒剂生物效价的比较[J].中国药业，2007，16（7）：10-11.