藏灵菇发酵乳中乳酸菌的分离纯化与鉴定

黄 颖,杜 娜,张,郑永晨*

藏灵菇是一种乳白色、胶质状的块状物(由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成),外形酷似米粒,上面栖息着多种微生物,经过长期在牛奶中培养,个体会增大很多,形状如盛开的雪莲,所以有人称之为“西藏雪莲”[1]。藏灵菇是一种天然的乳品发酵剂,有良好的发酵特性,用它制作的酸奶与传统的酸奶或用其它纯种乳酸菌发酵剂制成的产品有很大的不同,最显著的特征是除乳酸发酵外,还伴有轻微的由酵母菌引起的酒精发酵,是一种集酸、乙醇味于一体的新型发酵乳制品,将其作为乳品家族的一个新品加以开发,具有很好的市场前景。目前这种产品都是以藏灵菇为发酵剂进行制作,由于藏灵菇上微生物的组成比较复杂,用发酵剂传代的方法进行扩大生产,极易发生菌相失衡,使发酵乳的风味和品质发生变化,失去原有的优良特征,限制了它的工业化生产[2]。本研究对藏灵菇发酵乳中益生菌进行了分离和鉴定,以期为藏灵菇发酵工业中的发酵剂纯培养研究和产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 藏灵菇由吉林农业大学食品微生物教研室提供。培养基:MRS培养基,光明乳业无抗生素纯牛奶。

1.2 方法

1.2.1 藏灵菇发酵乳的制备 藏灵菇用无菌水冲洗后,按2%(W/V)的比例接种到纯牛奶中,30℃培养24 h,过滤出藏灵菇,再次加入到纯牛奶中培养24 h。如此连续活化3次,最后一次发酵乳滤液留备试验用。

1.2.2 乳酸菌的分离与纯化 藏灵菇发酵乳滤液1 ml,用无菌生理盐水以10倍稀释法稀释至10-5、10-6、10-7倍的稀释菌悬液。分别从上述2种菌悬液中选择3个最高稀释度,每个稀释度取0.1 ml,分别涂布于MRS平板,37℃培养48-72 h,然后挑取不同形态的典型菌落制片,革兰氏染色观察并进行接触酶试验。凡属革兰氏阳性菌兼接触酶阴性的菌落继续在原培养基上划线纯化,重复 2-3次,直至镜检为纯培养物止。纯化后的菌株接种至MRS斜面上培养,培养后至4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 乳酸菌的生理生化鉴定 包括明胶液化试验、石蕊牛乳试验、吲哚试验、淀粉水解试验、产硫化氢试验、硝酸盐还原试验、产黏液试验及糖发酵试验等[3]。

1.2.4 细菌 DNA的提取及16S rRNA的PCR扩增[4]细菌DNA的提取采用酚-氯仿法,1%琼脂糖凝胶电泳检测细菌DNA。以提取到的细菌DNA为模板,利用 Taq酶及 16S通用引物进行PCR扩增。PCR反应条件为:95℃5 min;94℃30 s,50℃30 s,72℃1 min,30个循环;72℃15 min;10℃5 min;4℃保存。

1.2.5 16S rRNA序列测定与分析 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工公司测序,序列提交NCBI数据库,搜索与测序结果相近序列进行比对。

1.2.6 菌株的生物学特性

①生长特性 将分离到的菌种按 3%接种量接种于MRS液体培养基中,37℃厌氧培养,每 2 h测定一次发酵液 OD600和pH。

②耐酸性试验 将活化3代的分离到的菌种悬液按3%的接种量分别接入pH 2.0和 3.0的MRS液体培养基中,37℃厌氧培养,分别于0 、30、60、90、120 min进行MRS平板菌落计数。

③耐胆盐试验 将活化3代分离到的的菌种悬液按3%的接种量分别接入含0.3%和0.5%胆汁盐的MRS液体培养基中,37℃厌氧培养,分别于0、2、4 h进行MRS平板菌落计数。

2 结果

2.1 藏灵菇发酵乳中乳酸菌属种的鉴定

本研究从藏灵菇发酵乳中分离到2株乳酸菌,其形态及部分生理学特性见表1。该2株菌均不运动,均在10℃下生长,45℃不生长,硝酸盐还原、明胶液化、产硫化氢及淀粉水解试验皆为阴性,结合糖发酵试验与16S rRNA测序比对结果,初步确定:LP1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);LA1为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

2.2 菌株的生物学特性

2.2.1 生长特性

LP1和LA1的生长曲线和产酸曲线如图1和图2所示。由图1和图2可知,LA1前8h生长缓慢,10 h后进入对数生长期,18 h后生长处于稳定期。LP1前10 h生长缓慢,12 h后进入对数生长期,20 h后生长处于稳定期。LA1产酸速度开始较快,8 h后pH就降至5以下,产酸平稳,pH基本维持在4.0左右。LP1产酸速度较慢,10 h后pH才降至5以下,产酸平稳,pH基本维持在4.2左右。

表1 藏灵菇发酵乳中乳酸菌鉴定结果

图1 LA1的生长曲线和pH值变化

图2 LP1的生长曲线和pH值变化

2.2.2 耐酸性实验

在120 min的培养过程中,pH 2时,LP1和LA1的生长均受到不同程度的抑制,30 min后LP1的活菌数开始明显下降,90 min后LA1的活菌数也迅速下降,120 min时,LA1的活菌数尚能维持在104cfu/ml水平,LP1仅达102cfu/ml,可见LA1的耐酸能力较LP1强。pH 3和4时,两株菌的活菌数在120 min虽都有所下降,仍可维持一个较高水平。

表2 菌株的酸耐受性能(活菌数log cfu/ml)

2.2.3 耐胆盐实验

在含胆盐浓度(m/v)为0.3%的液体MRS中培养4 h后,与不含胆盐的空白组相比,两株菌活菌数略有下降,但仍保持在107cfu/ml,活菌数差异并不显著。相对而言,0.5%牛胆盐对菌株的抑制作用稍强,在培养4 h后,LP1和LA1活菌数分别维持在104cfu/ml和106cfu/ml,LA1耐胆盐能力较强。

3 讨论

目前国内一些地区流行饮用藏灵菇浸泡奶,实质上是利用藏灵菇作为发酵剂,发酵牛奶。藏灵菇中微生物较普通酸奶发酵剂复杂,除含乳酸菌外,还含有酵母菌。现在对藏灵菇的研究,仅仅是从藏灵菇中分离出部分菌株,对藏灵菇中微生物的种群结构及发酵过程中的优势微生物缺乏了解,因而对藏灵菇作为发酵剂的发酵机理及其发酵奶所具有的保健效果不能做出科学的解释,使得藏灵菇在民间一直保持着神秘色彩。

表3 菌株的胆盐耐受性能(活菌数log cfu/ml)

本研究从藏灵菇发酵乳中分离到两株乳酸菌,对分离得到的两株乳酸菌进行了生理生化和16S rDNA序列同源性分析,并结合形态学特征确定这两株菌分别为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

由于乳酸菌必须进入人体的胃肠道才能发挥其功能,因此要求乳酸菌能耐受有机体的防御机制,其中包括胃液中的低pH和小肠中的高胆盐等[5]。生物学特性结果显示,LA1和LP1在pH 2.0和胆盐浓度为0.3%、0.5%的MRS培养基中分别培养2 h和4 h后,活菌数基本上仍可达到104cfu/ml,以上,表明具有较好的耐酸和耐胆盐能力。

藏灵菇是个复杂的微生物共生体系,其中应该还包括一些因试验条件所限而未分离出来的菌株,有待进一步深入研究。

[1]刘变芳,孔庆学,郭蔼光.自然发酵剂“西藏雪莲”的初步研究与菌种鉴定[J].中国酿造,2004,11(11):11

[2]周剑忠,董明盛,江汉湖.PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇发酵过程的优势菌[J].中国农业科学,2006,39(8):1632.

[3]东秀珠,蔡妙营.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[4]Giraffa G,Rossetti L,Neviani E.An evaluation of chelex-based DNA purification protocols for the typing of lactic acid bacteria[J].Journal of MicrobiologicalMethods,2000,42:175.

[5]辛 羚,郭本恒,吴正钧.3株乳杆菌在模拟消化环境中存活性能的研究[J].中国乳品工业,2005,33:15.