硅胶管包裹大鼠颈动脉对血管收缩功能的影响

谢莲娜，曾定尹，张海山，孙丹萌，庞雪峰，关启刚

（中国医科大学 附属第一医院心内科，沈阳 110001）

动脉壁由内膜、中膜、外膜三层结构组成。外膜为血管最外层结构，由较厚的致密结构组成，含有大量的胶原纤维和弹性纤维，细胞成分主要为成纤维细胞。越来越多的证据显示外膜调节血管功能的作用远大于其作为血管壁支撑结构的作用。Gonz觃lez等［1］发现去除血管外膜的大鼠颈动脉及肠系膜动脉对去甲肾上腺素的收缩反应明显减弱；提示血管外膜能调节血管平滑肌的收缩功能，参与血管张力的调节。通过损伤血管外膜的方法建立早期动脉粥样硬化动物模型被广泛应用于研究动脉粥样硬化的发病机理。动脉粥样硬化往往伴有血管收缩功能的改变，利用外膜参与血管张力调节的机制建立血管外膜损伤致血管痉挛的动物模型有助于深入认识外膜调节调节血管功能的作用机制。

本实验应用硅胶管包裹大鼠颈动脉外膜，观察血管外膜损伤对血管收缩功能的影响，探讨构建血管外膜损伤介导血管收缩性增强的大鼠颈动脉动物模型的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12周清洁级雄性Wistar Kyoto大鼠30只，体质量200~250 g（由吉林大学动物室提供）。普通大鼠食料喂养，自由进食、饮水。

1.2 硅胶管包裹大鼠颈动脉手术

手术在室温下进行。腹腔内注射水合氯醛30 mg/kg麻醉大鼠，仰卧固定于自制鼠板上（40 cm×60 cm）。颈前脱毛后常规碘酊、乙醇消毒。沿正中线纵形切开颈部皮肤，逐层钝性分离颈部筋膜及肌肉，暴露右侧颈动脉鞘，仔细游离出右颈动脉，长约15~18 mm。用内径1.5 mm、长12 mm的硅胶管纵向切开后包裹于右颈动脉外（包管侧）；左侧颈动脉未处理，作为自身对照（对照侧）。逐层缝合伤口，让大鼠自主恢复。术后3 d每日1次腹腔注射青霉素16万U，预防感染。

1.3 在体血管收缩性评价

包管术后 3 d（n=6）、1 周（n=6）、2周（n=6），用以上方法麻醉大鼠，暴露双侧颈动脉，去除右颈动脉包裹的硅胶管。将颈动脉置于已预热的超声血流量探头（2PSB，Transonic Systems Inc.，USA）内，稳定2 min后用超声实时外周血管血流量仪（TS420，Transonic system Inc.，USA）测定血流量（ml/min），同时用MP150多导生理记录仪（Biopac Systems，USA）连续记录颈动脉血流波形图。测完两侧基础颈动脉血流量后，用宽4 mm、4层厚纱布条围绕颈动脉中段。待血流量稳定，往纱布条上滴注用生理盐水配置的 5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT，美国 Sigma公司）0.05 ml。局部5-HT用量依次递增：10μg、50μg、100μg、500μg。每次局部应用 5-HT 后持续观察2 min，记录颈动脉血流量最大变化值，并连续记录血流量变化波形图。取出纱布条，室温生理盐水局部冲洗后更换新纱布条。稳定5~10min后进行下一浓度的5-HT诱发实验，直至结束。两侧颈动脉依次进行。为排除颈动脉血流量的个体差异，血管对5-HT的反应以与自身基础血流量比变化的百分数表示。

1.4 病理学检查

分别于术后 3 d（n=4）、1 周（n=4）、2 周（n=4）按前述方法麻醉大鼠，暴露双侧颈动脉，取目标血管（包管部位颈动脉及对侧相同部位颈动脉）约10 mm长。冰盐水冲洗后4%多聚甲醛固定，石蜡包埋标本。石蜡标本按3～4μm厚度连续切片，苏木素-伊红染色，在光学显微镜下数码照相输入计算机。用Image Pluse图像分析软件进行测量分析：测外弹力板围绕面积（external elastielamina area，EELA）、内弹力板内面积（internal elastielamina area，IELA）、平均外弹力板内管腔直径及平均内弹力板内管腔直径。计算中膜厚度（mediadiameter，MD）及中膜面积（mediaarea，MA）。MD=（平均外弹力板内管腔直径-平均内弹力板内管腔直径）/2；MA=EELA-IELA。EELA代表血管总面积；对没有内膜增生的血管环，血管环管腔横截面积（lumen area，LA）为IELA，对有新生内膜形成的血管环测LA，计算内膜增生面积（neointima area，NA）=IELA-LA。每个目标血管取3张切片测量后取平均值作为该标本的最终数值。硅胶管包裹导致血管形态学变化程度以与自身对照侧颈动脉比较变化的百分数表示。

1.5 统计学处理

用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，两侧颈动脉血流量及形态学分析所测值比较用配对t检验。多组间均数比较用单因素方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 硅胶管包裹对大鼠颈动脉血管形态学的影响

2.1.1 血管形态学改变：对照侧颈动脉手术后3 d、1周及2周血管形态无明显改变。硅胶管包裹大鼠颈动脉损伤血管外膜后，包管侧颈动脉血管出现明显的形态学改变。硅胶管包裹3 d，血管腔缩小、血管内皮完整、内弹力板轻度弯曲、血管壁增厚、血管外膜炎性细胞侵润。硅胶管包裹1周，血管腔明显缩小、内皮完整、内弹力板极度弯曲、内皮细胞变形并突向管腔、血管壁明显增厚、血管外膜大量炎性细胞浸润及滋养血管增生。硅胶管包裹2周，血管腔较包管1周时扩大，出现弥漫性内膜增生，新生内膜中主要是纵行排列的合成型的血管平滑肌细胞及单核炎性细胞；内弹力板弯曲现象消失；血管中膜平滑肌细胞复制及单核炎性细胞浸润，血管壁增厚；血管外膜炎性细胞浸润较1周时减轻（图1）。

2.1.2 形态学测量分析结果：形态学分析结果如表1所示。硅胶管包裹大鼠颈动脉3 d、1周及2周对照侧颈动脉的EELA、MA、MD及IELA均无明显差异。与对照侧比较：包管术后3 d包管侧颈动脉的EELA及MA无明显变化、MD增加（23.04±5.96）%（P=0.009）、IELA 缩小（12.15±2.29）%（P=0.003）；包管术后1周包管侧颈动脉的EELA缩小（35.41±3.41）%（P<0.001）、MA无明显变化、MD 增厚（61.65±10.32）%（P<0.001）、IELA 缩小（45.17±3.84）%（P<0.001）；包管术后2周包管侧颈动脉的EELA、MA及IELA无明显变化、MD增厚（31.52±4.56）%（P=0.012）、LA 缩小（37.17±4.57）%（P<0.001）、NA 平均（0.19±0.05）mm2。

表1 硅胶包裹后大鼠颈动脉血管形态学变化分析（x±s）Tab.1 Effect of collar-induced adventitia injury on rat carotid morphometry（x ±s）

2.2 硅胶管包裹对大鼠颈动脉血管收缩功能的影响

2.2.1 颈动脉血流量的变化：硅胶管包裹术后3 d、1周、2周，包管侧颈动脉血流量均较对侧明显降低，包管 3 d时分别为（3.35±0.77）ml/min和（4.55±0.92）ml/min（P=0.028）；包管 1 周时分别为（2.79±0.71）ml/min 和（3.64±0.83）ml/min（P<0.001）；包管 2周时分别为 （2.92±0.35）ml/min 和（4.35±0.97）ml/min，（P=0.0091）。见图 2。

表2 局部应用5-HT大鼠两侧颈动脉血流量变化率比较（x±s，%）Tab.2 Effects of collar-induced adventitia injury on vascular reactivity to serotonin（x±s，%）

2.2.2 颈动脉血管对局部应用5-HT的反应：局部应用递增剂量（10~500μg）5-HT诱发血管痉挛（n=6）结果如表2所示。随5-HT用量增加，两侧颈动脉血流量均在基础血流量的基础上呈剂量依赖性降低。硅胶管包裹大鼠颈动脉3 d，在较低剂量5-HT（10~50μg）时，包管侧颈动脉血流量下降程度与对照侧比较无明显差异；在高剂量5-HT（100~500μg）时，包管侧颈动脉5-HT诱发的血流量降低程度明显大于对照侧。硅胶管包裹大鼠颈动脉1周，局部应用递增浓度的5-HT，包管侧颈动脉血流量下降程度明显大于对照侧，这种差异在较低浓度5-HT时更明显，包管侧颈动脉5-HT诱发的最大血流量降低程度也明显大于对照侧。包管术后2周，包管侧颈动脉对局部应用5-HT的反应与对照侧比较无明显差异。

3 讨论

本研究结果显示，用硅胶管包裹大鼠颈动脉造成血管外膜慢性损伤后，早期出现血管收缩功能的改变，表现为血管中膜平滑肌慢性收缩、血流量降低及血管对5-HT的收缩反应增强；包管2周血管壁出现具有动脉粥样硬化早期特征的新生内膜病损。

3.1 硅胶管包裹大鼠颈动脉导致血管内膜增生

目前认为血管外膜是血管壁主要的“损伤-感应组织”。能“由外向内”影响血管功能及结构。众多研究证实血管外膜损伤能在短期内出现具有动脉粥样硬化早期特征的新生内膜。多种损伤血管外膜的方法被用来制造动脉粥样硬化的动物模型，包括外膜电刺激、血管外压迫、外膜剥离及血管外膜包管等。硅胶管生物相容性好、柔软、有弹性。Booth等［2］首先应用其包裹兔颈动脉制作动脉粥样硬化的动物模型：将一非闭合的硅胶管包绕于兔颈动脉外膜，在正常饮食的情况下，1周内包管处出现具有动脉粥样硬化早期特征的新生内膜病损。此后众多研究均证实用硅胶包裹血管的动物模型是研究动脉粥样硬化形成可靠、快速的方法。该动物模型的优点是：血管外包管不直接损伤血管中膜及内膜；而且在同一动物能同时得到正常及外膜受损的血管，因此可以利用两侧血管进行自身对照研究。目前该动物模型被广泛应用于研究动脉粥样硬化机制及药物疗效。以往多数该方面的研究主要是以兔颈动脉作为目标血管。但由于抗兔抗体较少，限制了该动物模型的更广泛应用。大鼠具有饲养方便、抵抗力强、相关抗体多等优势。既往报道应用球囊损伤大鼠血管内膜能诱发与人类动脉粥样硬化早期改变相似的病变［3］。本实验用大鼠作为实验动物，用硅胶管包裹大鼠颈动脉造成血管外膜慢性损伤，光镜下观察硅胶管包裹后3 d、1周及2周大鼠颈动脉血管壁形态学变化。结果显示硅胶管包裹损伤血管外膜后，大鼠颈动脉血管壁出现与硅胶管包裹兔颈动脉后相似的形态学变化。与以往报道的硅胶管包裹兔颈动脉1周出现弥漫性内膜增生不同的是，本实验硅胶管包裹大鼠颈动脉后1周无明显内膜增生，包管2周才出现明显的内膜增生。被广泛用于研究脑出血致血管痉挛的大鼠股动脉模型也证实经外膜刺激大鼠股动脉7~12 d血管主要表现为慢性痉挛，未见内膜增生性改变［4，5］。大鼠颈动脉对包裹硅胶管的反应与兔不完全相同，机理还不清楚，可能与动物的种属有关。本实验证实可以以大鼠作为实验动物，用硅胶管包裹颈动脉的方法制作外膜损伤致动脉粥样硬化模型用于探讨血管外膜在动脉粥样硬化形成中的作用及治疗方法。

3.2 硅胶管包裹大鼠颈动脉导致血管对5-HT反应敏感性增加

冠脉痉挛是众多缺血性心脏病包括变异型心绞痛、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死及猝死的基本发病机制。动脉粥样硬化在血管痉挛发病中具有重要的作用。目前认为血管平滑肌细胞收缩性增强是动脉粥样硬化引起血管痉挛的主要发病机理。从聚集的血小板中局部释放的5-HT是血管收缩的内源性刺激。在多种动脉粥样硬化动物模型中观察到血管选择性的对5-HT的收缩血管反应敏感性增加，如高胆固醇喂养的兔动脉粥样硬化模型［6］、高胆固醇喂养+球囊损伤猪冠脉血管内膜［7］等。人体动脉的离体研究显示粥样硬化血管对5-HT的收缩反应性增加［8］。临床研究显示动脉粥样硬化的患者对5-HT收缩血管反应的敏感性增高易诱发血管痉挛［9］。关启刚等［10］用白介素1包裹猪冠状动脉外膜介导冠脉病变的动物模型，证明在体情况下血管外膜慢性炎症刺激能导致血管对5-HT的收缩反应敏感性增加。硅胶管包裹兔颈动脉动物模型的早期研究证实，除了内膜增厚，包管部位的血管对5-HT的反应敏感性增加，且动脉对5-HT的超敏先于内膜增厚及其他与动脉粥样硬化有关的肉眼形态学变化［11］。以上研究为本实验动物模型的构建提供了充分的依据。本研究结果显示硅胶管包裹大鼠颈动脉3 d，血管对5-HT的收缩反应增加；包管1周，血管对5-HT的反应敏感性及收缩反应强度均明显增加，与以上研究结果一致，进一步证实外膜慢性损伤的早期阶段血管中膜平滑肌细胞收缩性增强。硅胶管包裹大鼠颈动脉2周，随着弥漫性新生内膜形成，血管对5-HT的反应敏感性及收缩反应强度均恢复至对照侧水平。

3.3 硅胶管包裹大鼠颈动脉导致血管中膜平滑肌细胞慢性持续性收缩

本实验利用硅胶管对血管外膜慢性刺激，构建血管收缩性增强的动物模型的另一依据来源于目前已广泛应用于研究蛛网膜下腔出血致脑血管痉挛机制的大鼠股动脉模型，该动物模型将自体血放置于大鼠股动脉外证实血管外膜刺激能导致血管慢性痉挛，表现为血管中膜增厚，血管腔横截面积缩小［4，5］。本实验应用硅胶管包裹大鼠颈动脉损伤血管外膜后，包管部位血管腔横截面积明显缩小，同时伴损伤侧颈动脉血流量明显降低。进一步测量分析发现硅胶管包裹早期尤其是在包管后1周时血管外弹力板内面积及内弹力板内面积均明显缩小，中膜面积无变化、而中膜厚度明显增加，同时伴有内弹力板弯曲，说明此阶段血管腔缩小主要源于中膜平滑肌的慢性收缩，与早期Iplikcioglu等［12］在大鼠股动脉观察的结果一致。包管后2周同样表现为血管腔横截面积缩小；不同的是内弹力板弯曲现象消失，内弹力板内面积无明显变化，出现弥漫性内膜增生，说明此阶段血管腔缩小主要源于血管壁结构性重构，表现为血管中膜增厚及新生内膜形成。以上结果证实硅胶管包裹大鼠颈动脉刺激血管外膜的的早期阶段血管中膜平滑肌细胞慢性持续性收缩，导致血管慢性痉挛。

血管外膜慢性损伤能引起血管收缩功能的改变，表现为血管中膜平滑肌慢性收缩、血流量降低及对血管5-HT的收缩反应敏感性增强。血管收缩功能的改变出现在内膜增生性病变之前。该动物模型可以被用来研究血管外膜慢性损伤致血管痉挛的机制及观察抗痉挛药物的疗效。

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