正交试验优选清肝利胆胶囊醇提工艺

澜兰·艾则孜，帕依曼·亥米提，于宁（1.新疆医科大学第一附属医院药剂科，乌鲁木齐市 830054；.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐市 830004）

清肝利胆胶囊是以藏医理论组方的现代藏药复方制剂，处方来源于藏药临床经验方，笔者已按中药、天然药物6（2）类完成了所有临床前的研究工作，现进行临床研究工作。本品处方由川西獐芽菜、波梭瓜子、唐古特乌头、角茴香、兔耳草、苦买菜、诃子、甘草、大黄、金钱草、木香等12味药材组成，具有祛湿除黄、清肝利胆和清热解毒的功效。方中各药分别被2005年版《中国药典》（一部）、《部颁标准·藏药分册》和《藏药标准》收载。由于处方中大黄含蒽醌类有效成分[1]，唐古特乌头和角茴香含有生物碱[2]，兔耳草、苦买菜和川西獐芽菜含有黄酮和皂苷类[3～5]，这些有效成分均有祛湿除黄、清肝利胆和清热解毒等药理作用[1～5]，因此，根据各药材有效部位和有效成分的理化性质，对这8味药材选用乙醇提取。为将本方开发成可供临床使用的工艺稳定、质量可靠的现代藏药复方制剂，笔者特对该复方进行了醇提工艺研究，优选出了合理可行的提取工艺。

1 材料

1.1 仪器

Libror AEG-200型电子天平（日本岛津公司）；SPD-10AVP型高效液相色谱（HPLC）仪，包括LC-10ATVP二元高压泵、SPD-10AVP紫外检测器、CTO-10ASVP柱温箱、SCL-10AVP系统控制器（日本岛津公司）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9023A型恒温箱（扬州三发电子有限公司）。

1.2 试药

大黄素、大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为0756-200110、0796-200208）；甲醇为色谱纯，HPLC用水为超纯水，乙醇为药用规格，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大黄总蒽醌的含量测定[6～8]

2.1.1 色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Shimadzu VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，5µm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），检测波长为254 nm，柱温为35℃，流速为1.00 mL·min-1。理论塔板数按大黄峰计算应＞3000。

2.1.2 对照品溶液的制备：称取大黄素、大黄酚对照品各适量，用甲醇（色谱纯）制成含大黄素4µg·mL-1和大黄酚8µg·mL-1的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备：称取本品约1.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加8%盐酸20 mL，超声处理5 min，再加三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加适量甲醇微热使溶解，转移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器，合并洗液至同一量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备：称取按处方比例除大黄以外的其它醇提药材，按清肝利胆胶囊醇提制备工艺制成阴性样品，按“2.1.3”项下方法制成阴性对照溶液。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.大黄素；2.大黄酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.emodin；2.chrysophanic acid

2.1.5 系统适用性试验：取上述对照品、供试品、阴性对照溶液，照“2.1.1”项下色谱条件注入液相色谱仪。经计算，大黄素的理论塔板数 n＝5.54（tR/Wh/2）2＝12971，分离度 R＝2（tR2－tR1）/（W1+W2）＝1.65，拖尾因子fs＝W0.05h/2d1＝0.97；大黄酚的理论塔板数 n＝5.54（tR/Wh/2）2＝13103，分离度 R＝2（tR2－tR1）/（W1+W2）＝6.31，拖尾因子fs＝W0.05h/2d1＝0.96，均符合2005年版《中国药典》的规定。在供试品的色谱图中，对照品峰位与阴性对照没有峰重叠，说明该法专属性良好。色谱见图1。2.1.6 线性关系考察：称取大黄素、大黄酚对照品适量，加甲醇（色谱纯）分别制成每1 mL含大黄素7.68µg和含大黄酚102µg的贮备溶液。分别精密量取上述大黄素对照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 mL，大黄酚对照品溶液0.5、1、2、3、4 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取上述溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，进行线性回归，得大黄素回归方程为A＝33319C+1536.1（r＝0.9996），大黄酚回归方程为A＝39750C+22239（r＝0.9993）。结果表明，大黄素、大黄酚检测浓度分别在0.768～3.84、2.04～16.32 μg·mL-1范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2 乙醇浸出物量的测定

精密量取乙醇提取液100 mL，置已干燥至恒重并称重的蒸发皿中，水浴蒸发干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷却，称重，重复3次，求得乙醇浸出物量。

2.3 正丁醇萃取物量的测定

精密量取乙醇提取液200 mL，加正丁醇萃取3次，第1次30 mL，第2、3次分别为20 mL，全部置已干燥至恒重并称重的蒸发皿中，水浴蒸发干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷却，称重，重复3次，求得正丁醇萃取物量。

2.4 三氯甲烷萃取物量的测定

精密量取乙醇提取液200 mL，加三氯甲烷萃取3次，第1次30 mL，第2、3次分别20 mL，全部置已干燥至恒重并称重的蒸发皿中，水浴蒸发干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷却，称重，重复3次，求得三氯甲烷萃取物量。

2.5 正交试验[9，10]

根据单因素和预试验结果，固定提取次数，选择乙醇浓度（A）、提取时间（B）和乙醇用量（C）为考察因素，采用正交试验设计。结合常用分析方法和目前能够得到有效成分对照品的情况，确定总蒽醌（即大黄素含量与大黄酚含量）、正丁醇萃取物量、三氯甲烷萃取物量和乙醇浸出物量为指标，综合评分（权重系数分别为0.5、0.2、0.2、0.1），优选最佳乙醇提取工艺。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

综合评分＝（总蒽醌/最大总蒽醌）×50%+（正丁醇萃取物量/最大正丁醇萃取物量）×20%+（三氯甲烷浸出物量/最大三氯甲烷萃取物量）×20%+（乙醇浸出物量/最大乙醇浸出物量）×10%。

按处方比例称取各味醇提药材，滤液定容，分别测定大黄总蒽醌、正丁醇萃取物量、三氯甲烷萃取物量、乙醇浸出物量。正交试验结果见表2。

由表2可知，各因素对综合评分的影响大小顺序为：A（乙醇浓度）＞B（提取时间）＞C（加醇量）；每个因素三个水平之间的趋势为 A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1；直观分析得提取工艺为A3B2C2，即加8倍量80%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。采用方差分析进一步优化，结果见表3。

由表3可知，A因素的影响具有显著性（P＜0.05），B和C因素的影响均无显著性（P＞0.05）。结合直观分析结果，以A3B2C2组合为佳，即加8倍量80%乙醇提取2次，每次1.5 h。据此条件对川西獐芽菜、波梭瓜子等8味药材进行验证试验，结果与正交试验结果一致，说明筛选出的最佳醇提工艺可行、合理、稳定。

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

3 讨论

本研究建立了以HPLC法测定清肝利胆胶囊中总蒽醌含量的方法，为进一步完善清肝利胆胶囊的质量控制标准提供了准确、简便、可行的测定方法。

根据处方中甘草等其余药材的药理作用、有效成分和有效部位选定水提取法，选择加水用量、提取次数和提取时间为因素进行正交试验，最终确定最佳水提工艺为加8倍量水提取3次，每次1 h。按上述工艺进行重复试验3批，测定每步工艺指标，证明本研究优选得的水提工艺合理、稳定、可行。故醇提工艺和水提工艺共同构成了清肝利胆胶囊的提取工艺。

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