莫达非尼对小鼠中枢谷氨酸水平的影响

栾家杰马张庆宋建国

（1皖南医学院弋矶山医院药剂科，安徽 芜湖 241001；2皖南医学院临床药学研究所；3皖南医学院定量药理研究所）

莫达非尼对小鼠中枢谷氨酸水平的影响

栾家杰1,2马张庆3宋建国3

（1皖南医学院弋矶山医院药剂科，安徽 芜湖 241001；2皖南医学院临床药学研究所；3皖南医学院定量药理研究所）

【摘要】目的：通过研究莫达非尼（modafinil，MOD）用药后小鼠各脑区谷氨酸含量的变化，探讨MOD中枢兴奋作用的可能机制。方法：MOD灌胃给药，测定给药后小鼠脑部各分区谷氨酸含量。结果：MOD使小鼠大脑皮层谷氨酸含量显著增加，该作用呈剂量依赖性，但对其他脑区谷氨酸水平无显著影响。结论：MOD用药后使小鼠大脑皮层谷氨酸含量明显升高，可能与其中枢兴奋作用机制有关。

【关键词】莫达非尼；脑药浓度；谷氨酸

莫达非尼（modafinil，MOD）是一种新型中枢兴奋药，具有促觉醒、抗帕金森病、增强认知能力以及抗疲劳等作用[1-6]，临床主要用于嗜睡、发作性睡病和抑郁症的治疗。MOD中枢兴奋机制十分复杂，可对中枢神经系统产生广泛的影响。文献报道，MOD可激动蓝斑核α1肾上腺素受体，而对蓝斑核以外的去甲肾上腺素能神经无明显作用[7]。MOD能促进并能较长时间维持大脑皮层兴奋状态，人或动物在用药后均可在较长时间内保持清醒状态[8]；对发作性睡病患者，MOD白天用药可显著减少发作次数和持续时间[9]。

与传统中枢兴奋药如苯丙胺等相比，MOD在兴奋中枢、增加动物自主活动的同时，无明显心血管不良反应，也无明显依赖性[10]，提示本品有完全不同于传统精神兴奋药物的作用机制。MOD这一特点已引起研究者的广泛兴趣和重视。但迄今为止，MOD的确切作用机制仍然尚未阐明，对其量效关系也未见详尽报道。

本研究拟通过研究不同剂量莫达非尼给药后小鼠脑部各分区谷氨酸含量的变化，为进一步研究MOD中枢兴奋作用的可能机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

1.1.1 实验动物雄性昆明种小鼠140只，体重（22±2.5）g，由南京青龙山动物繁殖中心提供（许可证号：SCXK（苏）2007-0001）。动物分笼饲养，控制室温（25±2℃）和湿度（＜60%），控制室内12 h明暗周期。动物可自由进食、进水，适应性饲养1周，实验前禁食12 h。

1.1.2 实验分组随机取128只上述动物，分为MOD 120 mg/kg组和对照组，每组64只，该组动物灌胃给药后，分别于给药前和给药后规定时间点分批处死动物，测定各脑区谷氨酸含量。

根据上述实验结果，再取12只上述动物，分为MOD 60 mg/kg组、MOD 240 mg/kg组，灌胃给药，在给药后1.5 h处死小鼠，分离出大脑皮层区域，测定谷氨酸含量，结合MOD 120 mg/kg组和对照组的实验结果分析量效关系。

1.2 药品、试剂和仪器

1.2.1 药品与试剂莫达非尼（纯度≥99%，中国药科大学医药化工研究所提供）；乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；乙酸钠（分析纯，合工大化学试剂厂）；柠檬酸（分析纯，恒源精细化工有限公司）；药品和试剂配制用水均为二次蒸馏水。

1.2.2 主要仪器Agilent高效液相色谱仪：二元泵、柱温箱、荧光检测器，自动进样器；PRO200电动匀浆器；CR22GⅡ高速低温离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 给药方法与取样时间灌胃给药，对照组给予等量生理盐水，分别于给药前和给药后0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6 h分批处死动物（n=8），测定各脑区谷氨酸含量。

1.3.2 脑部分区及脑匀浆制备将全脑分成七个分区：皮层（cortex）、纹状体（striatum）、海马（hippocampus）、丘脑（thalamus）、中脑（midbrain）、小脑（cerebellum）和延脑－桥脑（medulla pons-oblongata）。

小鼠断头处死，取脑组织称重，按1∶4（4 μL/mg）加入生理盐水，20 000 r/min，20 sec制备脑匀浆。取脑匀浆0.2 mL，加入7%高氯酸200 μL，混匀1 min，4℃下8 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样，分析MOD浓度。

1.3.3 标准曲线制备空白脑匀浆精密加入MOD标准品配成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L标准液。取标准液0.2 mL，加7%高氯酸200 μL沉淀蛋白，4℃下8 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样分析，建立MOD脑匀浆标准曲线。

1.3.4 谷氨酸测定方法采用高效液相色谱法测定谷氨酸浓度。色谱条件：流动相为0.1M乙酸钠/柠檬酸缓冲液（pH5.4）－乙腈60∶40（v/v），含EDTA·2Na 0.1 mM；流速为1.0 mL/min；Agilent SB-C8（4.6×150 mm）色谱柱；荧光检测器激发波长340 nm，发射波长450 nm；柱温30℃。

荧光反应剂制备：A液：0.1 M NaHCO3/NaCO3（pH9.6）缓冲液；B液：OPA 10 mg，加乙醇1 mL，再加2巯基乙醇5 μL，老化24 h；用时A液800 μL加B液200 μL混合。进样方法：抽取荧光反应剂10 μL，抽取样品20 μL，再抽取荧光反应剂10 μL，静置1 min，进样40 μL。

1.3.5 回收率和精密度按1.3.3方法，配置高、中、低（10、2.0、0.5mg/L）三种浓度的谷氨酸标准样，分别在同日内及不同日间进行处理后分析，测试方法的精密度，并按检出量与加入量计算相对回收率。上述三个浓度样本的日内精密度分别为1.25%、4.87%和6.79%；日间精密度分别为2.48、3.16% 和8.12%。三种浓度样本的相对回收率分别为99.12%、96.34%和85.71%。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS10.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 MOD对小鼠七个脑区谷氨酸水平的影响

MOD用药后，监测小鼠脑部七个分区谷氨酸水平，发现MOD 120 mg/kg剂量组用药后1.5 h小鼠大脑皮层谷氨酸含量明显增加（P＜0.01），其余六个脑区：纹状体、海马、丘脑、中脑、小脑及延脑－桥脑的谷氨酸水平与对照组相比，无明显变化（图1）。

图1 莫达非尼口服给药后1.5h不同脑区谷氨酸含量(n=8)注：**P＜0.01，与空白溶媒组相比

2.2 MOD用药后小鼠大脑皮层谷氨酸含量的经时变化

MOD 120 mg/kg剂量组用药后，小鼠大脑皮层谷氨酸水平经时变化曲线见图2。用药后1～4 h，大脑皮层谷氨酸含量与对照组相比有显著的统计学意义。

图2 莫达非尼口服给药后小鼠皮层谷氨酸水平经时变化（n=8）注：*P＜0.05，**P＜0.01，与空白溶媒组相比

2.3 MOD给药剂量－给药后大脑皮层谷氨酸含量的相关性

MOD使小鼠大脑皮层谷氨酸含量增加呈明显的剂量依赖性。在60～240 mg/kg剂量范围内，随着给药量增加，大脑皮层谷氨酸含量也随之增加，r=0.860 4，呈良好相关性（P＜0.01，图3）。

图3 莫达非尼对于小鼠皮层谷氨酸水平的剂量依赖性作用(n=6)

3 讨论

莫达非尼自问世以来，研究者对其中枢兴奋效应进行了大量研究，多数集中于该药对睡眠及自主活动的影响。关于MOD中枢作用的确切机制，至今仍不清楚。有文献报道，MOD可对中枢兴奋性递质5-HT、DA、NA和抑制性递质GABA产生影响[11-13]。谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的兴奋性递质，关于MOD对中枢谷氨酸水平的影响，尚甚少报道。Ferraro等证实，MOD能使内侧视前区（media preoptic area，MPA）和下丘脑后部（posterior hypothalamus，PH）GABA水平降低[14]。该研究还提示，MOD不仅通过单胺递质发挥作用，还可能对谷氨酸系统产生影响。MOD是否会引起部分脑区，尤其是大脑皮层谷氨酸含量发生改变？迄今尚未见进一步的研究报告。

本实验对MOD用药后小鼠脑部七个脑区的谷氨酸水平进行了监测，证实MOD用药后，小鼠大脑皮层的谷氨酸水平明显升高（P＜0.01），而其他六个脑区：纹状体、海马、丘脑、中脑、小脑及延脑－桥脑的谷氨酸水平未见明显改变（P＞0.05）。且MOD这一作用呈明显的剂量依赖性。大脑皮层兴奋性递质及抑制性递质水平的高低，一般可直接影响皮层的兴奋状态。该结果提示，MOD的中枢兴奋作用可能至少部分地与其升高大脑皮层兴奋性递质谷氨酸的水平有关。MOD使大脑皮层谷氨酸水平升高作用的详尽机制和意义尚有待进一步研究。

参考文献：

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基金项目：皖南医学院中青年科研基金资助项目（WK200703F）

作者简介：栾家杰，男，博士在读，主管药师，讲师。研究方向：临床药学及定量药理学。E-mail:luanjiajie757@medmail.com.cn宋建国，男，博士，教授，硕士生导师。通讯作者 E-mail:cpyjsyy@126.com

Effects of Modafinil on Concentration of Glutamic Acid in Mouse

Luan Jiajie1,2，Ma Zhangqing3,Song Jianguo3
(1Department of pharmacy，Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001，China;2 Laboratory of Clincal Pharmacy of Wannan Medical College;3 Laboratory of quantitative pharmacology of Wannan Medical College)

ABSTRACTObjective：To determine the glutamic acid content in seven different brain regions of mice,and to explore possible mechanism of central neural system stimulation of MOD.Methods：After oral administration of MOD, the content of glutamic acid was assessed in mouse brain to discuss the possible central stimulation mechanism of MOD.Results：Glutamic acid content in mouse cortex significantly increased after treatment of MOD and had a significant correlation with the brain drug concentration.Conclusion：MOD is easy to get through the blood-brain barrier and wildly distributed in the mouse brain.MOD effectively increases glutamic acid level in mouse cortex,which can be probably involved in the central stimulation of MOD.

KEY WORDSModafinil;Brain Drug Concentration;Glutamic Acid