食物过敏原表位定位技术的研究进展

武 涌，李 欣，陈红兵,*，高金燕

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学生命科学与食品工程学院食品系，江西 南昌 330047)

食物过敏原表位定位技术的研究进展

武 涌1,2，李 欣1,3，陈红兵1,2,*，高金燕3

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学生命科学与食品工程学院食品系，江西 南昌 330047)

表位是过敏原的物质基础，表位定位技术是过敏原表位研究的工具，包括表位定位和表位预测两种。新的表位定位技术主要包括噬菌体展示技术、质谱技术、表面等离子共振技术、蛋白芯片技术、核磁共振技术。相比于传统的过敏原表位定位技术，新的表位定位技术在灵敏度、准确性和快速等方面具有优势。表位预测是运用生物信息学方法对过敏原表位进行预测。本文将对新的表位定位技术在表位定位中的应用、表位预测以及相关应用进展进行阐述。

食物过敏；表位定位技术；表位预测

过敏原主要成分是蛋白质。过敏原表位是指抗原中参与抗体结合的部分，由5～7个氨基酸组成。表位是过敏原与抗体结合的物质基础，也是食物过敏反应的“元凶”。根据其结合受体细胞的不同，分为B细胞表位和T细胞表位；按表位结构的不同分为连续性表位和非连续性表位，前者又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成的，后者又称构象性表位，是由空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成的[1]。线性表位见于T细胞表位和部分B细胞表位，构象性表位存在于B细胞表位。不连续表位是近年提出的一种新的表位概念，是指抗原中几个不同区域的氨基酸序列在三维空间中形成的具有活性的表位[2-3]。

传统的表位定位技术如酶解技术、肽扫描技术有特异性差、费时和昂贵等缺点，而新的过敏原表位定位技术从噬菌体展示技术诞生开始有了新近展，1990年Scott等[4]首次将噬菌体随机多肽库应用于筛选抗原模拟表位。1999年，Mendoza等[5]基于ELISA检测原理将微孔板与蛋白微阵列方法相结合，创立了具有微型化、集成化、高通量化等优点的微孔板阵列蛋白芯片，至此拉开了蛋白芯片在过敏原表位定位应用的序幕。20世纪90年代发展起来的表面等离子共振技术是Fagerstam等[6]在生物特异性相互作用分析方面得到了广泛的应用。

核磁共振技术(NMR)是由Bloch等在1946年发现的，最近几年才应用于表位的筛选工作中[7]。质谱技术中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是19世纪80年代末问世并迅速发展起来的质谱分析技术，也是最近几年才用于筛选表位，也是表位定位最多的一种手段。表位预测主要是采用生物信息学的方法，对抗原表位进行预测。

食物过敏表位的定位不仅可以了解过敏原的结构与功能、抗原抗体反应等有关免疫反应的众多信息，而且对食物过敏原的检测、监控等方面也具有指导意义。

1 表位定位技术种类

表位定位主要分为表位预测和实验性定位两种。表位预测主要是根据蛋白质中氨基酸本身的特性和氨基酸的组成特点，预测构成表位的可能性。实验性定位主要有酶解技术、肽扫描技术、噬菌体展示技术、质谱技术、表面等离子共振技术、蛋白芯片技术和核磁共振技术等。本文主要探讨新的表位定位方法、表位预测以及应用进展。

2 表位定位技术的研究进展

2.1 噬菌体展示技术(phage display techniques)

早在1985年，Smith[8]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ中，使目的基因编码的多肽以融合蛋白形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术(phage display techniques，PDT)，该技术建立了基因与融合蛋白的统一，使基因型和表型直接和有效的对应。目前，用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统和噬菌粒展示系统。构建的商业化肽库短肽长度已由最初的6肽、7肽发展到9肽、15肽以至38肽、40肽[9]。噬菌体展示技术作为一项高通量筛选技术，现已被广泛地运用于抗原表位的定位，人工制备抗体，确定激素或受体的结合序列或酶的底物序列，筛选受体的激动剂或拮抗剂或酶的抑制剂等。

目前，运用不同的噬菌体库，可以筛选过敏原的线性表位和构象性表位的模拟肽，然后通过生物信息学的方法把模拟肽转变成相应的表位。如，李欣等[10]以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机7肽库，确定了6个与兔血清IgG结合的水牛乳β-乳球蛋白线性表位。另外，小清蛋白分子质量约为12kD，可以被超过90%的过敏患者的血清所识别，是鱼类食物中一种主要过敏原，以此过敏原为对象，Untersmayr等[11]使用M13衣壳蛋白PⅢ噬菌体展示文库对小清蛋白的表位进行筛选，通过4轮的筛选富集，分别得到5个同时与人血清IgG、IgE结合的阳性克隆，对所选克隆进行DNA序列分析，确定了3个模拟构象表位。

2.2 质谱技术

质谱技术(mass spectrometry)主要是针对分子间的非共价键反应如抗原-抗体间的特异性结合进行分析，其具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、分离和鉴定同时进行等优点，已得到广泛的应用。在定位表位的研究中，已发展出与质谱技术结合的一些技术，如酶解技术、表位足迹技术等。对于线性表位可以采取表位分离和表位提取技术，已有相关文献[12]对于此类方法进行报道。而在定位构象性表位时，则需要对肽段中的氨基酸进行不同的化学修饰或通过H/D的交换对蛋白骨架进行分析，进而得到过敏原的构象性表位[13]。其中，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)结合免疫亲和的亲和质谱技术是目前抗原表位分析的有效方法[14]。

亲和质谱是免疫亲和分离技术与现代质谱技术的结合，通过亲和质谱，是筛选抗原表位的有效方法，不仅可以直接获取抗原表位的准确分子质量，而且还可以获得抗原存在与否、抗原表位位点和氨基酸序列等信息。将肽段混合物与单克隆抗体进行作用，免疫沉降后，将特异性结合的肽段复合物与基质溶液混合直接进行MALDI-TOP质谱分析。此方法不需要分离得到结合后的肽段，质谱峰所对应的就是与抗体特异性结合的肽段。

牛乳α-乳白蛋白是一个球状单体钙结合蛋白(分子质量为14.2kD)约占乳清蛋白的25%。利用重组的牛乳α-乳白蛋白，Hochwallner等[15]通过亲和质谱，对IgE结合表位进行分析，发现重组的α-乳白蛋白可以与57.6%的牛乳患者血清中的IgE发生特异性的结合。

另外，卵白蛋白(ovalbumi，OVA or Gal d 2)是蛋清中的主要过敏原，约占蛋清蛋白的54%。Lopez-Exposito等[16]将卵白蛋白在400MPa的环境下进行胃蛋白酶水解，水解肽进行了反相高效液相色谱串联质谱(RPHPLC-MS/MS)分析，发现一些水解肽段含有能够和患者IgE特异性结合的表位。

2.3 表面等离子共振技术

表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance，SPR)是一种检测结合动力学非常有用的方法。它是一种物理光学现象，当入射光以临界角入射到两种不同透明介质界面时，可引起界面金属自由电子共振，电子能够吸收光能量从而使反射光在一定角度内减弱，其中使反射光完全消失的入射光角度称为共振角[17]。SPR随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此，可以通过对生物反应过程中共振角的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。检测表面等离子共振的仪器有Biacore

2000[18]，该系统可用于抗体鉴定、蛋白质组学、免疫原性等领域的应用。该技术具有无需标记、高通量实时分析的优点，现已广泛应用于研究各种分子相互作用的特性，包括抗体-抗原结合、配基-受体结合以及蛋白和DNA等的结合[19]，将表面等离子体共振技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行对比，发现这两种方法在检测抗原-抗体结合方面具有很强的互补性，表面等离子技术需要的样品量低，但步骤繁琐；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术不能直接检测动力学常数，但检测速度更快，分析比较容易[20]。这两种技术也可结合进行表位的定位，例如生物相互作用分析质谱就是该技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱结合的产物。综合表面等离子技术与质谱技术对过敏原表位进行定位，可实现定量与定性的结合。SPR技术在抗原-抗体结合动力学及抗原表位-抗体对位的筛选中具有重要的作用。通过标记抗原-抗体、动态反应抗体-抗原的结合与解离速率和亲和常数，从而监控特异性的抗原抗体反应。基于这种方法，可以筛选酶解后的线性表位或结合肽文库技术进行大量筛选。如，Karlsson等[21]运用SPR技术研究HIV-1核心蛋白P24与其单克隆抗体的结合动力学，通过芯片表面检测抗原-抗体结合过程，得到17个P24抗体的特异性表位。

目前，在食物过敏原表位定位中，运用SPR技术的文献暂未见报道，但类似的工作显示了该技术在食物过敏原表位中的应用前景。

2.4 蛋白芯片技术

最近几年在蛋白质组学的推动下，蛋白质芯片技术(protein microarray)发展很快，在生物学研究中已得到广泛的应用。在蛋白表达谱、蛋白-蛋白相互作用、抗原表位筛选等方面，已有相关的文献报道[22]。与传统的ELISA免疫测定方法相比，蛋白芯片技术具有同时分析多个目标蛋白的功能，并具有高通量、检测灵敏、样品用量少等特点。

该技术的基本原理是将蛋白质或肽段有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质或肽段结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质；再将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。

蛋白芯片技术对于细微的表位变化非常灵敏，并且对血清的需求量也比较少，展示了在大量过敏原表位检测方面的优越性。蛋白质徽阵列比传统肽扫描技术(peptide scan)主要优势在于使大量样本的平行分析成为可能，在制备微阵列的过程中，可以通过点样仪自动化的完成，并且在实际的操作中，能够节约样本和试剂的用量，缩短检测时间，提高敏感性方面，相对于肽扫描技术，有很大的优势。

应用蛋白芯片技术已成功地对牛乳过敏原等表位进行了研究。Lin等[23]通过合成含有牛乳主要过敏原表位的蛋白芯片，与5位牛乳过敏患者的血清进行特异性分析，发现以往运用SPOT技术定位出的表位在蛋白芯片上与IgE结合表位也有特异性反应，建立了运用蛋白芯片技术对牛乳过敏原表位进行大量定位的方法。此类方法也可运用到对其他食物过敏原表位定位的工作中。

目前为止，国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有11种，主要的3个过敏原是Ara h1、Ara h2和Ara h3[24]。Shreffler等[25]将主要花生过敏原的213个重叠20肽固定在载玻片上，用77位花生过敏患者的血清和15位对照血清进行特异性分析，发现了一个特异性很高的Ara h 1表位，同时也以蛋白芯片技术再次认证了花生的主要过敏原。另外，Hochwallner[13]在对重组α-乳白蛋白表位的检测过程中，也运用到了蛋白芯片技术来检测重组肽段与血清的特异性结合。

2.5 核磁共振技术

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是处于静磁场中的原子核在另一交变电磁场作用下发生的物理现象。因其具有迅速、准确等优点，该技术已广泛应用于蛋白质-配体间作用、抗原-抗体间作用、膜蛋白的识别等方面的研究[26]。但相比于质谱技术、表面等离子共振技术，灵敏度不是很高。目前，随着生物技术的发展，核磁共振已成为解析蛋白质空间结构的重要手段。核磁共振技术对表位定位的原理主要是根据抗原结合抗体与不结合抗体时，其位点的氨基酸残基的动力学值不同进行分析。因此，可以区分抗原结合表位以及肽表位识别抗体边缘残基。其解析蛋白质结构主要包括两个过程：1)化学位移指认；2)结构约束的测定。迄今为止，可以对小于30kD的蛋白质溶液三维结构进行测定。Pomes[27]指出通过X射线晶体衍射结合核磁共振技术，能够对过敏原的构象性表位进行预测。

NMR技术可分为：1)分子间Overhauser效应(NOE)类；2)磁化转移类；3)自扩散系数扰动类；4)弛豫速率扰动类；5)化学位移扰动类。分析蛋白质-配体分子间NOE结合同位素(15N、13C等)编辑/滤波技术，可获得分子内和分子间的距离约束，通过相关软件的分析，能够得到抗原-抗体复合物的完整结构。如Wilkinson等[28]分析scFv片段与Fab片段间NOE结合同位素(15N/1H)编辑技术，研究scFv-IL-1β复合体的空间结构。类似的方法已经运用到抗原表位的筛选工作中，如HIV-1的表位定位的研究中已运用到此类技术[29]。核磁共振技术在进

行定位表位的工作中，也可结合其他的方法，如诱变[30]使得在定位构象性表位时更加准确。

在食物过敏原表位的研究中，有文献报道[31]，通过X射线晶体衍射技术配合15N、15N-13C同位素标记的核磁共振，得到了樱桃过敏原Pru av 1的三维空间结构以及IgE结合表位。

2.6 表位预测技术

目前，表位的预测主要包括B细胞线性表位、B细胞构象性表位、CTL表位及Th表位等抗原表位预测方法，其中CTL表位预测和Th表位预测是针对T细胞表位。

在预测B线性表位方面，主要公认的方法有6种：亲水性方案、可及性方案、抗原性方案、可塑性方案、电荷分布方案和二级结构预测方案。对于构象性表位，则采用计算机预测和实验相结合的方法进行分析和定位，一些可用的基于Web的预测软件已经公布，如CEP软件、Disc-Tope软件和MEPS软件。基于噬菌体展示筛选模拟肽的技术，是将获得的亲和性模拟肽集合进行对比，然后基于某种算法预测构象性表位。主要代表性的算法有Pepitope算法、3DEX算法和MIMOX算法，这3种方法都提供了网络预测服务[32-34]。在预测构象性表位的方法中，还有Halperin等[35]提出的SiteLight算法，Mumey等[36]提出的FindMap算法以及Moreau等[37]提出的MIMOP算法，但运用最多的还是前面提供的3种算法。

在T细胞表位预测中，CTL表位预测主要是MHC I类分子肽预测，Th表位预测是MHCⅡ类分子的亲和肽预测。MHC分子亲和肽的预测方法主要有序列相似性预测法、分子建模法、结合基序法、定量矩阵法和机器学习法5种[38]。预测Th细胞表位比较先进的方法是机器计算法，该方法能够提高预测的特异性、准确性和适用性[39]。

胡纯秋等[40]采用SOPMA和DNAStar软件预测该蛋白质的二级结构以及通Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法分别预测其抗原指数、亲水性、表面可及性、柔韧性等参数，得出序列28-31、56-73、76-90、156-158、168-169区域最可能是Ara h 2.02蛋白的B细胞抗原表位的优势区域。

以上的预测方法还不能完全表现出体内的实际特异性结合情况，并且还存在着一些局限性，但随着生物信息学的发展，食物过敏原表位预测必将会取得突破性的进展。

3 结 语

通过以上的综述，不难发现在表位的定位过程中，噬菌体展示技术、质谱技术、表面等离子共振技术、蛋白芯片技术、核磁共振技术相比于传统的技术在灵敏度、样品用量、分析速度方面都有一定的优势。根据不同的食物过敏原，在筛选过程中可以根据不同的需要选择适合的方法。随着对食物过敏原表位定位技术不断丰富和完善，过敏原表位将会被更多的定位出来，对食物过敏原表位的认识也将更加透彻。检测定位出的过敏原表位可替代对食物过敏原的检测，使检测结果更加准确，检测方法将更加灵敏，食品的安全性也将随着表位定位技术的发展而提高。

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Research Progress on the Epitope Mapping Technology for Food Allergens

WU Yong1,2，LI Xin1,3，CHEN Hong-bing1,2,*，GAO Jin-yan3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Department of Food Science, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Epitopes is the material basis of allergens. Epitope mapping technology is the tool for studying allergen epitopes, which involves epitope mapping and epitope prediction. In recent years, there have been some newly emerging epitope mapping technologies include phage display techniques, mass spectrometry, surface plasmon resonance, protein microarray and nuclear magnetic resonance. Compared with the traditional epitope mapping technology, they have advantages of high sensitivity and accuracy as well as rapidity. Epitope prediction is a prediction of allergen epitopes achieved by means of the bioinformatics methods. This paper reviews the applications of the aforementioned epitope mapping technologies in epitope prediction and research progresses on epitope prediction.

food allergy；epitope mapping technology；epitope prediction

TS201.6

A

1002-6630(2010)23-0406-05

2010-08-11

教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目(NCET-08-07-04)；国家自然科学基金项目(30860220)；

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目(SKLF-MB-200807)；江西省青年科学基金项目(2009GQN0089)

武涌(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学分子生物技术。E-mail：CDkey918@163.com

*通信作者：陈红兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com