几种基因差异表达分析技术在原核生物差异基因筛选中的应用

胡 烨,李 影,钱爱东

(吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118)

由于基因组学研究的发展,近年对基因的研究已由静态的结构研究转向动态的基因表达和功能研究,以基因组功能研究为主要目标的后基因组时代即将来临,基因功能信息的获取将成为后基因组研究的重点。而差异基因和基因差异表达的研究是获取基因功能信息的重要方法,目前筛选并克隆差异基因也已成为当前分子生物学研究的热点之一。然而,值得注意的是此方面的研究目前大都局限于真核生物领域,而在原核生物差异基因筛选方面的研究颇少。

目前研究基因差异表达的技术大都是以m RNA为材料进行的,而原核生物由于其mRNA缺少po ly(A),因此要获得其足够的m RNA是非常困难的[1-2]。虽然目前已有一些富集原核生物m RNA的试剂盒,但由于RNA本身特点所致其富集m RNA的效率不是很高[3-5]。因此,许多差异表达分析技术无法应用于原核生物差异基因的筛选。然而对于原核生物差异基因的研究,尤其是一些致病菌的研究同样是十分有意义的。本文就几种可应用于原核生物的基因差异表达分析技术做简要介绍。

1 代表性差异分析法

代表性差异分析法(representational difference analysis,RDA)基本原理是将差减杂交与PCR结合,根据以双链DNA为模板进行PCR扩增时产物呈指数扩增,而以单链DNA为模板则呈线性扩增的原理,首先提取处理组和对照组的总RNA或mRNA,反转录成cDNA,用识别4个碱基的内切酶充分消化,然后进行PCR,使两组cDNA片段得以富集,接着连续进行3次差减杂交,去除共有基因,最后利用PCR技术富集试验组中特异表达基因的cDNA片段[6]。

与其他方法相比,cDNA-RDA具有以下几个优点:①cDNA-RDA技术富集差异表达基因的效率比其他方法高,可以筛选出低拷贝的差异基因。这是因为该技术通过酶切,简化了基因组DNA的复杂性而大大提高了消减杂交的消减富集;另外通过PCR扩增进行了高效的动力学富集[7];②cDNARDA与mRNA-DD相比,它通过PCR扩增及消减杂交,抑制了群体间共有基因片段扩增,使差异表达基因呈指数扩增,增加了群体间差异基因(阳性基因)的灵敏度,大大地减少了假阳性的出现率。③cDNA-RDA使用较长的引物(24mer),避免了在mRNA-DD技术中使用短的随机引物引起的错误匹配,且其得到的扩增子基本上可以代表整个cDNA信息[8];④cDNA-RDA技术除可以发现Driver和Tester间存在的基因表达差异外,还可进行组间“双向”差减,并可进行直接克隆和测序;如果降低Driver和Tester的比例,可用于筛查相对差异;⑤在试验过程中可及时对差减杂交的效果进行检测,避免人力、物力不必要的浪费。而且对试验仪器要求较简单,一般的实验室都可以展开此方面试验。

当然,cDNA-RDA技术也存在着一些不足。如试验步骤比较复杂,对试验样品要求较高,限制性内切酶可能造成的cDNA两端的信息丢失等。但因其显著的优点cDNA-RDA方法目前已被广泛的应用于基因差异表达研究,尤其是现在研究较少的原核生物的差异基因筛选。与真核生物相比,原核生物的m RNA非常的不稳定,一般情况下在37℃其mRNA半衰期只有1.5min～2.5 min;而且由于其mRNA缺少poly(A),无法使用Oligo(dT)进行常规的m RNA纯化[9]。因此,目前在原核生物差异基因表达方面的研究,大都是以总RNA为试验材料代替m RNA来进行研究,Bow ler L D等[10]发展了cDNA-RDA方法,并成功的将其应用于脑肺炎双球菌的差异基因筛选。以编码与铁元素调节相关的乳铁蛋白受体基因缺失N.meningitidis(CE1402)和其同系菌株N.meningitides(M 986)为对象,分别将其置于铁元素充分以及铁元素缺乏的环境中培养。最终成功的得到5个PCR扩增产物,其中包括去铁元素调控相关的基因片段lbpA和frpC。

2 抑制消减杂交法

抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)是以抑制PCR为基础的cDNA差减杂交技术。通过抑制PCR完成检测子和驱动子单链cDNA丰度的均等化;通过差减杂交去除检测子和驱动子之间的共同序列,使检测子和驱动子之间的不同序列得到扩增,从而富集差异表达基因。整个过程既利用了差减富集又利用了抑制PCR技术的高效动力学富集,因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异的cDNA的概率,简化了差减文库的分析。

SSH是目前为止较为简单有效的寻找差异基因的方法,其主要优点如下[11]:①灵敏度高。一般说来,经过SSH,稀有丰度cDNA能富集1 000倍～5 000倍,这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分子也有可能被检出;②提高了基因克隆的效率,由于使用4碱基内切酶使得基因(组)的复杂程度降低,大大提高了信息量,在一次SSH试验中可同时分离出上百个差别表达的基因;③假阳性率低;④操作简单,速度快,效率高。一次SSH可以同时分离到几十甚至几百个差异表达的基因[12];⑤PCR产物既可用作探针作文库筛选,也可直接进行克隆,构建差减文库。

但是,SSH也有缺点,如其对于材料的要求较多。该技术需要几微克的m RNA,若mRNA量不足,很可能检测不到低丰度差异表达基因的cDNA。这一点使SSH技术在原核生物的研究领域应用受限。对于原核生物差异基因的研究,多是对于其基因组的比较差异研究,然后再间接研究差异表达的基因[13]。有人采用SSH对BCG及其相关结核分支杆菌进行了基因组差异性研究。发现BCG较产毒株缺失了3个独立基因区,并将其命名为RD1、RD2和RD[14]。利用SSH对水、陆两栖动物和人致病菌水生气单胞菌产毒株PPD134/91及非产毒株PPD 35/85进行了基因差异显示研究。共获得69个PPD 134/91株特异片段,其中23个片段所编码的16个ORF与其他细菌已知蛋白具有高度同源性,而剩余的46个片段所编码的ORF被认为是该菌所特有的蛋白质[15]。

用可以降解甲苯的恶臭假单胞菌建立了一个应用于原核生物的模式系统[16]。发现超过90%的克隆序列都含有编码于甲苯相关酶类的基因片段,并对其中来自于3个主要操纵子的20个显著的甲苯相关基因进行了测序。该方法可以作为针对原核生物的差异基因鉴定的针对性研究方法,称该方法为应用于原核生物的SSH PCR cDNA消减方法[17]。

3 互补脱氧核酸扩增片段长度多态性技术

互补脱氧核酸扩增片段长度多态性技术(DNA amplified fragment length polymorphism,cDNAAFLP)技术结合了RT-PCR和AFLP技术,其基本原理是以纯化的m RNA为模板,反转录合成cDNA。用识别序列分别为6 bp和4 bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA,酶切片段与人工接头连接后,利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增,扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示[18]。

cDNA-AFLP的主要优点有:①转录产物高度表达时,扩增条带的强度能够准确反映基因间表达量的差别。②“假阳性”低。在RNA指纹图谱分析等技术中,如何证实被分离的电泳条带和证实最初扩增反应体系中被标记和识别的条带是个难点[19]。而cDNA-AFLP技术,只需要增加选择性碱基长度即可排除PCR中非目标电泳条带的扩增。③重复性高。cDNA-AFLP技术在cDNA酶切片段两端加上了接头片段,增强了引物结合的特异性,其重复率可达95%以上[20]。

cDNA-AFLP方法大都应用于高等生物体或是植物的基因表达特性的研究,而从未在原核生物差异基因表达方面应用。近几年来逐渐有报道应用该方法研究原核生物的差异基因表达[21]。用该方法研究胡萝卜软腐欧文菌的两个亚种Eca和Ecc,根据该菌3′末端保守序列片段合成短寡聚核苷酸引物(11-mer),通过PCR扩增出两亚种中已知的14种基因[22],因其cDNA的逆转录程度较高,也进一步说明其cDNA的有效基因区表达程度较高。通过该方法筛选出胡萝卜软腐欧文菌两个亚种的差异基因,证明其与来自于野油菜单胞菌的无毒力基因在蛋白水平上及其相似,并且通过Northern分析也进一步证实了该差异基因[23]。此后,应用此方法研究了胡萝卜软腐欧文菌并与大肠埃希菌进行了比较分析研究[24]。

4 限制性酶切片段差异显示

限制性酶切片段差异显示(restriction fragment differential display PCR,RFDD-PCR)技术是在传统m RNA差异显示技术(DD-PCR)基础上进一步发展而来的。RFDD-PCR不是直接扩增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA,再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。正是RFDD-PCR系统使用了一系列特殊接头和引物,特异性PCR引物的使用和下游的PCR反应使RFDD-PCR分析具有高度的重复性,解决了第一代差别显示系统的重复性问题;因为RFDD-PCR技术不使用以poly(A)为引物的PCR扩增,因而该系统对原核和真核系统皆适用。而该技术也正由于其实用性更完善而被认为是更加完善的第二代差异显示系统。

相对于传统的差异显示技术,RFDD-PCR主要具有以下显著优点:①最大的特点是由于其采用特异性配对于接头的引物进行PCR扩增,因而其PCR具有高度的重复性而极大地降低了假阳性率;②该方法PCR不以poly(A)为引物,使得该方法不会出现传统PCR方法所出现的扩增序列多为靠近poly(A)的非表达序列的情况[25]。因此,该技术对原核和真核系统都适用;③使用标记引物来扩增使得差异条带的检测更加便利、灵敏,并且每一步都设定了指标以便检验。

用该方法检测李斯特菌抗片球菌素单核细胞基因412型变体与野生型的差异表达[26],结果发现2个突变体都有3个基因片段同时表达上调。对传统方法进行改良,用5′-T25 V(V=A、C、G)引物进行cDNA第1链的合成,再用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第2链[27],纯化后用TaqⅠ限切酶酶切验证后的双链cDNA,再用T4 DNA连接酶连上接头,选择64个3′延伸引物中的一个和共用的标记5′端引物配对来进行降落PCR扩增。最后回收凝胶片段重新PCR扩增,杂交验证、测序后分析结果数据。结果发现两个突变体都有3个基因片段同时表达上调。经过Northern杂交得到同样的结果,进一步证明了RFDD-PCR方法的高度重复性。

5 结语

基因差异表达技术的出现曾使生命科学领域发生了革命性的突破,这些技术在真核生物方面的研究日趋成熟,可是在原核生物领域的研究却曾经一度止步不前。随着后基因组时代的到来人们不断的对现有的技术加以改进;根据实际情况将多种技术相互融合,使这些技术发挥的空间不断扩大。由于这些技术的逐步完善,使得其在原核生物领域的应用不再是个难题。上述4种技术目前都已经成功地应用于原核生物差异基因的研究,也为分子生物学研究开创了新的研究领域。当然,每种方法都有其自身不足的地方,但由于其各自特有的独特优点,已经开始应用于原核生物研究领域,因此研究者应根据自身研究目的,选择合适的技术进行研究,最大限度的发挥每种技术的特有优势。

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