枣花蜜中清除DPPH自由基的活性成分

穆雪峰，孙丽萍*，徐 响，庞 杰

枣花蜜中清除DPPH自由基的活性成分

穆雪峰1,2，孙丽萍1,*，徐 响1，庞 杰2

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

通过HPLC-DPPH和清除DPPH自由基实验研究枣花蜜中对DPPH自由基具有清除作用的活性成分，并测定已知活性成分的含量。结果表明：枣花蜜中存在12种对DPPH自由基有清除作用的活性成分，其中4种是已知化合物——咖啡酸、对香豆酸、山奈酚和柚皮素，其含量在48.8～741.3μg/100g，各成分对DPPH自由基的清除能力存在明显差异，其差异与分子结构密切相关。

枣花蜜；活性成分；DPPH自由基；分子结构

枣树(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科落叶乔木或灌木，原产我国，世界有100多种，我国有十几种，皆为蜜源植物。枣花蜜为我国众多大宗商品蜂蜜中的一种，有特殊的枣花香味，味甜，不易结晶等特点。枣花蜜主要产于我国山东、河南、河北等省。蜂蜜是药食兼用的天然绿色食品，含有黄酮类、酚酸、抗坏血酸、类胡萝卜素及过氧化物酶等多种生物活性成分[1-3]，具有抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗癌、清除自由基、消炎抑菌、预防心脑血管疾病等生理及保健功能[4]。

国内外对枣花蜜抗氧化活性研究不少，大部分研究集中在枣花蜜提取物对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基、脂质过氧化自由基和人体血清脂蛋白氧化修饰等的清除作用[5-7]。有关枣花蜜中抗氧化活性成分的研究尚未见报道。本实验采用HPLC-DPPH和清除DPPH自由基实验，研究枣花蜜中对DPPH自由基具有清除能力的活性成分，对其中的已知化合物进行含量测定，分析构效关系，为揭示蜂蜜抗氧化功能的物质基础提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

枣花蜜产自北京怀柔，由北京君健生蜂产品有限公司提供。

AB-8大孔树脂 安徽三星树脂科技有限公司；Sephadex LH-20、DPPH、咖啡酸、对香豆酸、柚皮素、山奈酚 美国Sigma公司；甲醇(色谱纯) Fisher公司；其他试剂均为分析纯。

AL204电子天平 梅特勒-托利多(上海)公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；Synergy HT酶标仪 BioTek基因有限公司；HL-2B数显恒流泵 上海

精科实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

取枣花蜜170g，去离子水(1:6，m/V)溶解后上AB-8大孔树脂柱，40%～95%乙醇梯度洗脱，洗脱液脱醇后乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，记为样品B。用少量甲醇溶解样品B，样采用Sephadex LH-20柱，用25%～80%乙醇梯度洗脱，洗脱液脱醇后乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，记为样品C。

1.2.2 HPLC-DPPH实验

取一定质量浓度的样品B甲醇溶液100μL，加100μL 1.8mg/mL的DPPH甲醇溶液，作为实验组，避光反应1h；取一定质量浓度的样品B甲醇溶液100μL，加100μL甲醇，作为空白组。液相条件参考Letcia等[8]方法并稍作改变。色谱柱：Sham-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm)；流动相：甲醇-甲酸水(水含有磷酸体积分数为0.2%)：甲醇体积分数为：0～10min，5%～17%；10～20min，17%～26%；20～40min，26%～58%；40～50min，58%～95%；50～60min，95%～5%。流速：1.0mL/min；温度40℃；各进样20μL，检测波长为320nm。清除率计算如公式(1)。

式中：S1为空白组对应吸收峰的峰面积；S2为实验组对应吸收峰的峰面积。

1.2.3 清除DPPH自由基实验

参考杨佳林等[9]的方法略有改动。向96孔板中加入100μL不同质量浓度的咖啡酸、对香豆酸、柚皮素、山奈酚甲醇溶液，再分别加入100μL 0.13mg/mL DPPH甲醇溶液，混合均匀，室温下避光反应35min，于517nm波长处测定吸光度，记为A1；同时以100μL DPPH溶液与100μL甲醇溶液混合后的吸光度记为A2；以100μL甲醇与100μL咖啡酸、对香豆酸、柚皮素、山奈酚溶液混合后的吸光度记为A0。平行测定3次，分别以试样质量浓度和清除率进行线性回归并计算IC50。清除率计算如公式(2)。

1.2.4 已知化合物含量测定

将质量浓度为144μg/mL的咖啡酸、对香豆酸、柚皮素、山奈酚混合标准液，用甲醇等比稀释后进行HPLC分析。液相方法同1.2.2节，进样20μL，平行测定3次。以混合标准液质量浓度与峰面积绘制标准曲线, 进行线性回归；同时取样品C甲醇溶液进样20μL，根据混合标准品的回归方程计算已知化合物含量。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，其甲醇溶液呈紫色，在波长517nm处有最大吸收。当有抗氧化剂存在时，生成DPPH-H分子，溶液的紫色向黄色变化，吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈定量关系，通过测定样品对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱[10-11]。

HPLC-DPPH是一种将HPLC和抗氧化活性测定相结合的方法，向含有抗氧化成分的甲醇溶液中加入DPPH甲醇溶液，用HPLC分析充分反应后的混合溶液，根据样品在添加DPPH溶液前后峰面积下降的程度评价活性成分的抗氧化能力[11]。若样品中存在对DPPH具有清除作用的抗氧化成分，该成分在色谱图中对应的吸收峰会下降或消失。采用HPLC-DPPH实验，向样品B甲醇溶液加入DPPH甲醇溶液后进行液相分析，根据空白组和实验组对应吸收峰面积的变化，计算枣花蜜中活性成分对DPPH自由基的清除率，结果见表1。

表1 枣花蜜中对DPPH自由基具有清除作用的活性成分Table 1 Bioactive components scavenging DPPH free radicals found in date honey

由表1可知，枣花蜜中存在12种对DPPH自由基有清除作用的活性成分。根据反应前后峰面积变化可知，保留时间为5.98、12.97、18.98min吸收峰消失，表明1#、2#和4#成分对DPPH自由基具有极强的清除作用；保留时间为13.66、37.48、43.07、51.99min吸收峰峰面积明显下降，表明3#、9#、11#和12#成分具有很强的清除DPPH自由基的能力，经计算，其清除率在84%以上；保留时间为25.74、26.75、34.58、39.73min的吸收峰反应前后面积变化较小，说明6#、7#、8#和

10#成分清除DPPH自由基的能力较弱，清除率在16%～33%之间；而保留时间为24.65min的5#成分清除率仅为2.15%，表明5#成分对DPPH自由基的清除能力极弱。由此可见，枣花蜜中不同活性成分对DPPH自由基清除能力强弱不同，可能与其含量和分子结构有关。

图1 4种活性成分的液相色谱和紫外图谱Fig.1 HPLC chromatograms and UV spectra of four identified bioactive components

通过样品B甲醇溶液与标准品的液相图谱和紫外图谱对照发现(图1)，4#、5#、10#和11#活性成分分别为咖啡酸、对香豆酸、柚皮素和山奈酚，其余8种活性成分，根据最大吸收波长判断有可能是酚酸或黄酮类物质，纯化和鉴定工作正在进行。

由HPLC-DPPH实验可知，枣花蜜中对DPPH自由基有清除作用的活性成分包含咖啡酸、对香豆酸、柚皮素和山奈酚，因此以清除率和IC50为指标考察4种已知化合物质量浓度为72μg/mL时的DPPH自由基清除能力，结果如表2所示。

表2 4种活性成分对DPPH自由基清除率(x±s)Table 2 Scavenging capacities of four identified bioactive components on DPPH free radicals (x±s)

由表2可知，咖啡酸、对香豆酸、柚皮素、山奈酚质量浓度均为72μg/mL时，4种活性成分对DPPH自由基的清除作用强弱依次为：咖啡酸≈山奈酚＞对香豆酸＞柚皮素。在4种活性成分清除DPPH自由基的IC50实验中，当柚皮素质量浓度高达5.44mg/mL时，其对DPPH自由基清除率仅为26.72%，而其他3种活性成分对DPPH自由基清除作用的IC50依次为山奈酚(59.01± 0.41)μmol/L、咖啡酸(69.37±0.33)μmol/L、对香豆酸(10.01±0.87)mmol/L。由此可知咖啡酸、对香豆酸、柚皮素和山奈酚对DPPH自由基的清除作用差异极大，山奈酚和咖啡酸的清除能力相当，山奈酚稍强一些，而对香豆酸和柚皮素的清除能力远差于山奈酚和咖啡酸，不到二者的百分之一。

2.2 抗氧化活性与分子结构的关系

由清除DPPH自由基实验可知，在相同质量浓度(72 μg/mL)下，咖啡酸和对香豆酸对DPPH自由基的清除能力分别为96.56%和16.72%，说明咖啡酸对DPPH自由基的清除能力明显强于对香豆酸，这可能与其分子结构有关。对于羟基肉桂酸类的酚酸类化合物，苯环有无羟基以及羟基的个数对其清除自由基的能力有显著影响，随着苯环上羟基数量的增加，清除自由基的能力显著增强，尤其是苯环上3,4位的邻羟基可以稳定苯环供氢后的结构[12]。咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸)在苯环对位和间位上存在邻位羟基结构，而且羟基对位含有给电子取代基团CHCHCOO－[12]，见图2，因此咖啡酸具有较强的DPPH自由基清除活性；而对香豆酸(4-羟基肉桂酸)苯环上少一个羟基且没有邻位羟基结构，见图2，使其对DPPH自由基的清除能力明显减弱。

图2 咖啡酸和对香豆酸分子结构Fig.2 Molecular structures of caffeic acid andp-coumaric acid

图3 柚皮素和山奈酚的分子结构Fig.3 Molecular structures of naringenin and kaempferol

山奈酚和柚皮素对DPPH自由基的清除能力分别为95.72%、11.12%，说明柚皮素对DPPH的清除率远不及山奈酚。由图3可知，山奈酚(3,5,7,4’-四羟基黄酮)含有4个羟基且3,5位的羟基会形成分子内氢键；2,3位存在双键会形成共轭效应[12]，这些结构提高了山奈酚对DPPH自由基的清除能力，因而具有较强的抗氧化活性。柚皮素(5,7, 4'-三羟基黄酮)与山奈酚相比，不具有3,5位的羟基结构且少1个羟基，因此对DPPH自由基的清除能力相对微弱。

综上所述，不同抗氧化活性成分的抗氧化能力与其分子结构密切相关。这一结果与付军放[11]的研究结果一致。

2.3 抗氧化活性成分含量测定

本实验采用HPLC法测定枣花蜜中对DPPH具有清除作用的4种已知活性成分的含量，结果见表3。

表3 枣花蜜中4种活性成分含量(x±s)Table 3 Contents of four identified bioactive components in date honey (x±s)

由表3可知，枣花蜜中4种已知活性成分的含量分别为：咖啡酸(48.8±0.2)μg/100g、对香豆酸(156.2± 7.9)μg/100g、柚皮素(741.3±9.4)μg/100g、山奈酚(157.3±6.1)μg/100g，它们的含量存在一定的差异，其中柚皮素的含量最高；对香豆酸和山奈酚含量相当，咖啡酸含量最低。

3 结 论

本实验以枣花蜜为原料，采用HPLC-DPPH和清除DPPH自由基实验研究枣花蜜中对DPPH自由基具有清除作用的活性成分。结果显示：枣花蜜中存在1 2种对DPPH自由基具有清除作用的活性成分，各成分清除能力存在较大差异，活性成分中4种为已知化合物，其含量为咖啡酸(48.8±0.2)μg/100g、对香豆酸(156.2±7.9) μg/100g、柚皮素(741.3±9.4)μg/100g、山奈酚(157.3± 6.1)μg/100g；清除DPPH自由基能力最强的是山奈酚IC50为(59.01±0.41)μmol/L，其次是咖啡酸IC50为(69.37± 0.33)μmol/L，对香豆酸和柚皮素对DPPH自由基清除能力较弱，清除DPPH自由基能力的强弱与活性成分本身的分子结构密切相关。

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Analysis of Bioactive DPPH Free Radical Scavenging Components in Date Honey

MU Xue-feng1,2，SUN Li-ping1,*，XU Xiang1，PANG Jie2
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The bioactive components in date honey having the ability to scavenge DPPH free radicals were quanlitatively and quantitatively analyzed by HPLC-DPPH. In total, 12 DPPH free radical scavenging components were found in date honey, and 4 of them were identified as caffeic acid, p-coumaric acid, naringenin and kaempferol. The contents of these components were in the range of 48.8 to 741.3 μg/100 g honey. The scavenging capacities of these bioactive components exhibited an obvious difference, which was highly correlated with the molecular structures of bioactive components.

date honey；bioactive components；scavenging effect on DPPH free radicals；molecular structure

S896.1

A

1002-6630(2010)21-0119-04

2010-08-27

国家现代农业(蜂)产业技术体系建设专项(NYCYTX-43)；科技部农业科技成果转化资金项目(2009GB23260456)；中国农业科学院科研经费项目

穆雪峰(1983—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：mxf3814@163.com

*通信作者：孙丽萍(1963—)，女，研究员，硕士，研究方向为蜂产品功能因子的分离与纯化。E-mail：caasun@126.com