热休克蛋白 70对幼鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

王伟 薛丽霞

心肌保护的目的是当心脏停跳，生理性冠状动脉灌注停止后，由人工降低和(或)维持心肌细胞的代谢需要，从而最大限度地减少心肌细胞的缺血性损伤，保障心脏复跳后最大限度的心肌细胞结构完整，功能代谢等方面正常。心肌保护的方法，与心肌细胞自身的代谢状况、结构功能特点等密切相关。婴幼儿未成熟心肌与成熟心肌在上述几方面都有较大的差异，因此对成熟心肌的保护方法不一定适宜于未成熟心肌。随着先天性心脏病外科手术的发展，患者日趋低龄化使得未成熟心肌保护课题的研究日益重要，故随着婴幼儿心脏外科的发展，未成熟心肌保护问题亟待解决。目前诱导热休克蛋白(HSP)多用热休克法、感染性休克法等。药物诱导少有报道，而该方法较其他方法更适于临床应用。在体心肌缺血再灌注更接近活体生理。本实验采用幼鼠在体心肌缺血再灌注模型，用川芎嗪诱导 HSP70以观察其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及幼鼠心肌的细胞的病理改变和细胞超微结构的变化，旨在探索更适合未成熟心肌的保护方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 主要仪器:Heracus超速冷冻离心机;Thermo Forma超低温冰箱;FHS-2型可调高速匀浆器;小型动物呼吸机;全自动生化分析仪;多功能心电监护仪;OLYMPUS显微镜及显微摄像系统;JEM-1200EX透射电子显微镜。

1.1.2 主要材料及试剂:无水乙醇 (分析纯:北京化工厂20010821);甲醛 (分析纯:北京化工厂 20010821);盐酸川芎嗪注射液[北京四制药厂京卫准字第(80)第 422号]。

1.2 实验动物及分组 取体重 60～75 g SD幼鼠(＜21 d)96只，雌雄不限。由本院动物中心提供。随机分为 3组:(1)假手术(sham control，SC)组，(2)缺血再灌注 (ischem ia reperfusion，IR)组，(3)IMP预处理后缺血再灌注(TMP p reconditioning ischem ia reperfusion，TMP+IR)组。 3组于 4个时间点:TMP+IR组腹腔注射 TMP(100 mg/kg)，SC组、IR组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液后 12、24、36、48 h(每个时间点 8只)制作心肌缺血再灌注模型，SC组开胸后左前降支只穿线不结扎。

1.3 手术操作过程 20%乌拉坦(4mg/kg)腹腔麻醉，做颈部正中切口，气管切开插管做机械正压通气。通气频率65次/min，潮气量 5～6m l。针电极插入四肢皮下，记录心电图。经胸骨正中开胸，剪开心包膜暴露心脏，在冠状动脉左前降支(LAD)起始部，用 0/4 Proleno滑线穿越左前降支下方心肌表层，在线下垫一硅胶管(结扎 LAD用)，结扎滑线阻闭左冠状动脉，松开滑线后则再通。心肌缺血的确认依靠心电图 ST段抬高，局部心肌变紫、红且有节段性运动不良。各组幼鼠均于结扎 LAD 30min，再灌注 120m in(假手术组只穿线不结扎，静置 150min)后处死。

1.4 样本的制备 麻醉状态下于再灌注 120min后心脏取血2ml，离心(3 000 r/min)15min，制备血清，检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)活性。取缺血区心肌组织，4%甲醛溶液固定 24h，光镜切片，以检测 HSP 70含量。

1.5 血清CK-MB及LDH的检测 于再灌注 120min后心脏取血 2ml，离心(3 000 r/min)15min，制备血清，采用全自动生化分析仪测定血清中两种酶的含量。

1.6 免疫组化SP法检测心肌组织HSP 70 阳性细胞的细胞浆染成棕黄色。

1.7 统计学分析 应用 SPSS 11.5统计软件，计量资料以 ¯x±s表示，采用 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 幼鼠血清 CK-MB浓度测定结果 IR、SC组各时间亚组CK-MB的含量差异无统计学意义(P＞0.05);IR组CK-MB含量明显高于 SC组(P＜0.01)，TMP+IR组 CK-MB含量明显低于 IR组(P＜0.01)，但高于 SC组(P＜0.01)，TMP+IR 24 h亚组的 CK-MB含量明显低于 TMP+IR 12 h亚组(P＜0.05)，并随时间延长有不断升高的趋势。见表 1。

表 1 幼鼠血清 CK-MB浓度测定结果n=32，U/L，¯x±s

2.2 幼鼠血清LDH浓度测定结果 IP组、SC组本组各时间亚组 LDH的含量均无统计学意义(P＞0.05)，IR组LDH含量明显高于 SC组(P＜0.01)，TMP+IR组 LDH含量明显低于IR组(P＜0.01)，但高于 SC组(P＜0.01)，TMP+IR 24 h亚组的 LDH含量明显低于TMP+IR 12h亚组(P＜0.05)，并随时间延长有不断升高的趋势。见表 2。

表 2 幼鼠血清 LDH浓度测定结果 n=32，U/L，¯x±s

2.3 幼鼠心肌组织HSP 70光密度 OD值测定结果 SC组仅有少量的HSP 70表达，4个时间点光密度值差异无统计学意义(P＞0.05);IR组蛋白表达量高于 SC组，差异有统计学(P＜0.05)，TMP+IR组 4个时间点的光密度值明显高于 IR组(P＜0.01)，TMP+IR 24、36、48 h亚组 的光密度值高于TMP+IR 12 h亚组(P＜0.05)，以给药后 24 h亚组 HSP70表达量最多，光密度值随时间的延长有不断降低的趋势。见表3。

表 3 幼鼠心肌组织 HSP70光密度 OD值测定结果n=32，¯x±s

2.4 幼鼠心肌组织电镜超微结构观察 透射电镜观察幼鼠心肌缺血再灌注 120min后的心肌细胞，SC组:心肌细胞完整，肌原纤维排列整齐，Z线、M线清晰;富含线粒体且结构正常，嵴排列整齐、密集;核膜完整，染色质均匀，细密(图 1)。IR组:肌原纤维部分溶解，Z线增宽、扭曲，其它各带模糊，肌膜线粒体膜破损明显，可见线粒体肿帐，嵴排列紊乱，局部或整个线粒体嵴断裂溶解和空泡化，局部核膜破坏(图 2)。TMP+IR组:肌纤维结构基本正常，Z线、M线清晰可见，肌纤维排列较整齐，线粒体嵴较密集，无明显空泡形成，核膜完整(图 3)。

图 1 幼鼠正常心肌超微结构(×6 600)

图2 IR组心肌超微结构(×6 600)

3 讨论

本实验采用在体幼鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤模型，观察药物预处理对未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用，及初步探讨川芎嗪诱导 HSP 70对心肌损伤的保护机制。

目前关于心肌缺血再灌注损伤模型的制备主要有离体心脏灌注模型(即 Langendorff灌注模型)、在体心脏冠脉结扎、心肌细胞培养 3种方法，而对于未成熟心肌的研究，由于造模动物体形较小，LAD纤细，如采用在体结扎法手术难度较大，故其造模方法主要为离体心脏灌注和心肌细胞培养。但是这两种方法由于脱离了机体内环境，断绝了机体的神经、体液的调节及各脏器之间的协调性而不能很好的模拟活体处于心肌损伤时的状态和环境条件。所以本实验采用幼鼠(4～21 d)在体心脏冠状动脉结扎法以摒弃前两种方法的不足，从而更好地模拟婴幼儿先天性心脏病术后心肌损伤发病情况。心肌缺血再灌注损伤程度与缺血和再灌注时间有密切关系，为了能成功制造心肌缺血再灌注损伤模型，避免实验动物死亡率过高，故选择缺血 30m in，再灌注 120min的时间，并作了预实验，预实验结果表明模型是成功的。心肌缺血再灌注损伤的主要原因之一是通过黄嘌呤氧化酶途径产生大量氧自由基，同时体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等自由基清除剂酶活性降低，组织内抗氧化能力下降。大量心肌酶CK、LDH等从坏死的心肌细胞中漏出。膜对离子的转移功能产生障碍，引发心肌细胞电活动紊乱，导致严重的心律失常。血清中 CK-MB(能较准确的反映心肌的损伤程度)和LDH的活性可反映心肌缺血再灌注损伤的程度;电镜下可直观地观察心肌细胞结构超微变化，因此，本实验以血清中CK-MB和 LDH活性及电镜下的心肌细胞结构超微变化，来初步评价川芎嗪诱导HSP 70对心肌缺血再灌注损伤的影响是可行的。

由于考虑到临床的可行性，本实验采取川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP四甲基吡嗪)腹腔注射来诱导 HSP 70的产生，实验结果证明是可行的:川芎嗪干预组心肌 HSP 70的含量明显高于缺血再灌注组，且各项指标反映该组心肌的损伤情况比缺血再灌注组明显减轻，受损心肌得到保护。川芎嗪注射液临床上常用于抗血小板聚集，扩张小动脉改善微循环，有活血化瘀的作用，对已聚集的血小板有解聚的作用。

Currie等[1]研究认为HSP的诱导不仅增强心肌功能修复而且也增强心肌内皮功能恢复，并可延长心脏停跳时间，这进一步说明 HSP与心肌保护之间的密切关系。HSP 70转基因鼠的心肌抗缺血再灌损伤能力显著提高，直接证明了 HSP 70的心肌保护作用[2，3]。Amrani等[4]研究认为 HSP的诱导不仅增强心肌功能恢复而且也增强心肌内皮功能恢复，可延长心脏停跳时间，为心脏移植的供体保护提供了新方法。有研究发现心肌缺血时间小于30min是可逆性损伤阶段，心肌未坏死而出现心肌顿抑，心肌顿抑能诱导 HSP的表达[5，6]。这也可能是在本实验 IR组中受损心肌有一定量HSP 70表达的原因，但是此种心肌顿抑诱导方式还不足以对受损心肌产生足够的保护作用。而药物干预组的 HSP 70含量却明显增加，心肌的保护效果较好，推测可能还是川芎嗪为HSP 70的主要诱导因素。目前在诱导 HSP 70进行机体器官保护实验中，大多数实验结果证实HSP 70在诱导后 24 h达到最高峰值，对组织器官的保护效果也达到最好。Currie等[1]将SD大鼠行热休克预处理，待其恢复 24h后进行离体 Langendorff心脏缺血 /再灌注试验，结果发现热休克组明显改善缺血/再灌注损伤后心肌力学指标的恢复，减少心肌肌酸激酶释放，减轻心肌超微结构损伤，而心肌中过氧化氢酶(catalase)活性明显高于对照组。Karmazyn等[7]将雄性大鼠置热环境中使其肛温升至 42℃并维持 15min，在其恢复后不同时间检测心肌HSP表达及心功能指标，结果表明:恢复后 24 h诱导出HSP高表达，心功能恢复明显优于对照组，热休克组冠状动脉流出液中肌酸肌酶明显低于对照组。这在本实验中得到证实:在川芎嗪干预后24h亚组心肌 HSP 70表达量最高，心肌 CK-MB、LDH含量较其他各组下降明显，心肌超微结构损伤减轻，在这一点上实验结果与多数文献报道相符。而在随后的 36 h亚组、48h亚组HSP 70则呈逐渐下降的趋势，心肌保护效果也逐渐下降，HSP70的这一表达特性在将来临床手术时机的选择上对我们有重要的提示。CK广泛存在于细胞浆中，尤以心肌细胞为多，而 CK-MB是其较敏感反映心肌损伤的同工酶。当心肌细胞损伤时CK-MB渗出，血液中活性升高，故血清 CK-MB活性越高，证明心肌损伤亦越重，LDH亦然。本实验以血清LDH、CK-MB活性来判断心肌损害程度。实验结果表明，缺血再灌注组血清 LDH、CK-MB显著增多，与假手术组比较有显著性差异(P＜0.01)。川芎嗪干预组血清 LDH、CK-MB明显降低(与缺血再灌注组比较P＜0.01)。

心肌保护的目的是当心脏停跳，生理性冠状动脉灌注停止后，由人工降低和/(或)维持心肌细胞的代谢需要从而最大限度地减少心肌细胞的损伤，保障心脏复跳后最大限度的结构完整和功能代谢等方面正常[7]。心肌保护的方法，与心肌细胞自身的代谢状况、结构、代谢功能特点等密切相关[8，9]。我们发现临床上术前就已经处于缺氧状态的婴幼儿先心病患者占先心病总数的 15%～30%。缺氧未成熟心肌与正常未成熟心肌的区别在于前者在术前就已经存在缺氧损害，随着缺氧增加，高能磷酸盐水平下降，产生酸中毒，导致心肌收缩力下降和心功能衰退[10]。无氧代谢增加，减少了糖原水平，使心肌对缺氧耐受力更差[11]。低温减少氧耗并不能终止氧耗，且干扰心肌能量的生成，使缺氧心肌即使是在含有较丰富代谢底物的环境中，也不能充分利用，不利于能量的再生[12]。另外，快速降温易产生冷挛缩，产生心肌的无意义舒缩活动，反而消耗能量。在本研究中缺血再灌注组心肌受损较重，电镜超微观察心肌肌节断裂，线粒体肿胀明显，内外膜模糊不清，嵴断裂消失。川芎嗪干预组肌原纤维排列整齐，各肌节清晰，线粒体损伤较轻，可见线粒体轻度肿胀，内外膜较清晰，未见破碎线粒体。HSP 70作为一种在进化过程中有高度保守性的应激蛋白，它在防止热应激和其它应激引起的细胞损害或者使受损的细胞恢复方面起着重要作用。

本实验应用川芎嗪预处理诱导心肌细胞产生HSP 70，通过检测心肌细胞的各项指标和电镜超微结构观察，证实应用川芎嗪来诱导心肌细胞产生HSP70的方法是可行的。

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