新辅助化疗对骨肉瘤组织中 β-catenin蛋白表达的影响

杨建柱 孙丽霞 丁洋 刘俊茹 王冬 高峰

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，恶性程度高，易发生肺转移。随着新辅助化疗的临床广泛应用，术前化疗已成为骨肉瘤治疗不可缺少的手段。对术前化疗的反应是最敏感的预后指标，且对指导术后化疗有重要意义。研究发现，β-catenin和多种癌的侵袭和转移关系密切[1，2]。然而迄今 β-catenin蛋白在骨肉瘤中表达的意义以及新辅助化疗对其表达影响的相关性研究鲜见报道。本研究用免疫组化的方法检测骨肉瘤化疗前、后β-catenin蛋白表达变化，旨在探讨新辅助化疗对骨肉瘤β-catenin蛋白表达的影响及其与临床病理特征的关系，并观察化疗前、后 β-catenin蛋白表达变化与肿瘤细胞坏死率(TCNR)的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院 2004年 1月至2008年1月穿刺活检确诊的 54例骨肉瘤病例，先进行新辅助化疗，再进行瘤段切除加假体置换术。54例骨肉瘤患者中，男 35例，女 19例;年龄12～49岁，平均年龄 22岁。组织学类型:成骨细胞型 32例，成软骨型 12例，成纤维型 5例，特殊类型 5例(毛细血管扩张型1例，低级别中心性 2例，骨旁骨肉瘤1例，骨膜骨肉瘤 1例)。Enneking GTM临床分级:Ⅱb期 46例，Ⅲ期 8例。HE切片由两位资深病理学医生诊断核实。部位:胫骨 21例，股骨 23例，肱骨上端 5例，髂骨、耻骨 3例，腓骨 2例。另取同期骨样骨瘤 11例，骨母细胞瘤 7例，良性病变中的反应性新生骨区域 8例。所有患者均先接受 4种药物的新辅助化疗，包括甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)8 g/m2(16 ～ 10 g)，阿 霉 素 (doxorubicin，ADM)30mg/m2连续 3 d，顺铂(cisplatin，CDP)100mg/m2，异环磷酰胺(ifosfamide，IFO)3g/m2，连续 5 d。一般为 2～ 4个疗程，每疗程间隔 10～14 d，然后进行手术，手术通常为瘤段切除加假体置换术。术后根据术前新辅助化疗疗效，再常规进行 8～12个疗程的辅助化疗。

1.2 试剂与方法 鼠抗人β-catenin单克隆抗体，超敏免疫组化染色试剂盒、DAB显色剂等，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组化 SP法，实验步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3 结果判断标准 β-catenin:按照 Maruyama等[3]的方法分类，从细胞膜、细胞质、细胞核三个方面判断 β-catenin在细胞中的特征:70%的肿瘤细胞细胞膜表达阳性为正常表达，反之为表达缺失;细胞膜表达缺失或＞10%肿瘤细胞细胞质或细胞核阳性均为异常表达;对异常表达情况再按着色强度和阳性细胞比例进行综合评分，阳性比例 30%以下为 1分，30%～60%为2分，60%以上为 3分，着色程度:无着色为 0分(阴性)，浅黄色为 1分(弱阳性)，棕黄色为 2分(阳性)，棕褐色为 3分(强阳性)，然后根据两者乘积的积分进行统计分析，0～3分为弱阳性(+)，≥4分为阳性(++)。TCNR是目前国际公认的从病理角度判断化疗效果较为精确的方法。具体计算参照夏贤良等[4]的方法。骨肉瘤肺转移的诊断:术后每个月定期复查胸部 X线片，若 X线片可疑时立即 CT扫描。

1.4 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，计数资料采用χ2检验、Fisher's精确概率法检验，化疗后 β-catenin蛋白表达变化等级资料两样本比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访结果 骨肉瘤 54例，随访时间:5～52个月，平均26.4个月。术后 2年内肺转移率 58.97%(23/39)，2年存活率为 52.17%(24/46)。其中 8例失访，7例是否发生肺转移不详，未列入统计之列。

2.2 免疫组化染色结果 β-catenin蛋白在大部分反应性新生骨、骨样骨瘤、骨母细胞瘤中正常表达，表现为沿胞膜分布棕黄色颗粒，而在骨肉瘤中易位至胞浆和(或)胞核，为异常表达(图 1、2)。β-catenin蛋白异常表达率在反应性新生骨、骨母细胞瘤、骨样骨瘤及骨肉瘤中分别为 12.5%、28.57%、27.27%、66.67%。其中骨肉瘤组β-catenin蛋白异常表达率明显高于骨样骨瘤/骨母细胞瘤组和反应性新生骨组(P＜0.01)。但 βcatenin蛋白阳性表达率在骨样骨瘤/骨母细胞瘤组和反应性新生骨组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。

表 1 β-catenin蛋白在新辅助化疗前骨肉瘤、骨样骨瘤、骨母细胞瘤以及反应性新生骨中的表达 例

2.3 新辅助化疗前β-catenin蛋白异常表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 β-catenin蛋白异常表达率在骨肉瘤肺转移组明显高于无肺转移组(P＜0.05)。除此以外，二者与患者的年龄、性别、发病部位、病理类型、临床分期、化疗后 TCNR均无关(P＞0.05)。见表 2。

表 2 新辅助化前 β-catenin蛋白异常表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 例

2.4 新辅助化疗后骨肉瘤组织中β-catenin蛋白表达的变化新辅助化疗后 54例骨肉瘤中β-catenin蛋白由低表达或高表达转为阴性表达的分别是10例和 11例;由高表达转为低表达的有 9例;阳性表达程度不变的有 5例;另有 1例反而由低表达转为高表达。新辅助化疗前、后β-catenin蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.01)，见表 3。新辅助化疗后骨肉瘤中 β-catenin蛋白由高表达变为低表达或表达消失(图 3)。但骨肉瘤化疗前、后 β-catenin蛋白的表达与 TCNR未存在明显相关性(P＞0.05)。

图 1 骨母细胞瘤中β-catenin蛋白胞膜表达(SP法×100)

图2 化疗前穿刺活检骨肉瘤标本β-catenin蛋 白胞 浆/核 表 达(SP法 ×100)

图 3 新辅助化疗后骨肉瘤组织 β-catenin蛋白阴性表达(SP法 ×100)

表 3 新辅助化疗后骨肉瘤组织中 β-catenin蛋白表达的变化例

3 讨论

β-catenin是 Wnt信号途径中的一种转录激活因子，在细胞中以两种形式存在:(1)结合型，与上皮钙黏附素(E-cadherin)结合于细胞膜的内表面，形成E-cadherin/catenin复合体，介导同种细胞间的黏附;(2)游离型，参与 Wnt信号转导途径，通过核膜进入到细胞核内，与 DNA亲和蛋白 LEF/TCF(lym phoid enhancer factor/T cell factor)结合，激活 Wnt途径靶基因(如 C-myc、cyclinD 1、MMP-7、CD44、Claudin-1等)，在肿瘤发生发展过程中扮演了重要的角色[5]。

本研究结果表明，从反应性新生骨、骨样骨瘤/骨母细胞瘤、骨肉瘤，β-catenin蛋白的异常表达率逐渐增高，且骨肉瘤中β-catenin蛋白的异常表达率明显高于反应性新生骨、骨样骨瘤/骨母细胞瘤组。由此说明，β-catenin蛋白在骨肉瘤的发生中发挥了一定作用，检测 β-catenin蛋白对成骨性肿瘤良、恶性判断有参考价值。从新辅助化疗前 β-catenin蛋白的表达与骨肉瘤患者临床病理特征的关系的研究发现，β-catenin蛋白异常表达与患者是否发生肺转移呈正相关，这与 Iwaya等[6]的研究结果一致。这说明 β-catenin蛋白与骨肉瘤的进展有关，检测β-catenin蛋白可预测患者是否发生肺转移，在一定程度上可判定患者预后。

本研究发现新辅助化疗可降低β-catenin蛋白的异常表达，从而降低患者的肺转移发生率，但β-catenin蛋白与TCNR未发现有相关性。化疗可能通过下调骨肉瘤细胞β-catenin蛋白异常表达从而影响其生物学活性。对比检测化疗前、后β-catenin蛋白的表达，一定程度上可评价化疗的疗效，从而指导术后个性化化疗。β-catenin的异常表达增强骨肉瘤肺转移能力的机制目前尚不完全明了。一方面，骨肉瘤中 β-catenin胞膜表达的消失可能降低了同种细胞间的黏附，有利于肿瘤转移。另一方面，Iwaya等[6，7]在 Dunncell(有高度转移到肺潜能的鼠骨肉瘤细胞系)及骨肉瘤切除标本均未发现 β-catenin外显子的突变，说明其他调节机制在激活β-catenin通路中发挥作用。Arnsdorf等[8]认为 N-cadherin介导的 β-catenin信号途径在成骨细胞的分化中发挥着重大作用。

β-catenin在骨肉瘤的异常表达可导致肺转移的发生，因此β-catenin及其分子可能成为未来肿瘤治疗的一个靶点。对其转移机制的深入研究可以进一步有效地指导肿瘤转移的治疗。

1 Li S，Jiao J，Lu Z，etal.An essential role for N-cadherin and beta-catenin for progression in tongue squamous cell carcinoma and their effect on invasion and metastasis of Tca8113 tongue cancer cells.Oncol Rep，2009，21:1223-1233.

2 王菲莉，郭翔，袁太泽，等.Wnt-1、β-catenin在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义.癌症，2009，28:91-95.

3 Maruyama K，Ochia A，Akimoto S，etal.Cytoplasm ic beta-catenin accumulation as a predictor of hematogenousmetastasis in human colorectal cancer.Oncology，2000，59:302-309.

4 夏贤良，杨迪生，范顺武，等.下肢骨肉瘤高温隔离灌注化疗初步报告.中华骨科杂志，1994，14:645-648.

5 Voutilainen KA，Anttila MA，Sillanp??SM，et al.Prognostic significance of E-cadherin-catenin complex in epithelial ovarian cancer.Clin Pathol，2006，59:460-467.

6 Iwaya K，Ogawa H，Kuroda M，et al.Cytoplasm ic and/or nuclear staining ofbeta-catenin isassociated with lungmetastasis.Clin Exp Metastasis，2003，20:525-529.

7 Haydon RC，Deyrup A，Ishikawa A.Cytoplasm ic and/or nuc lear accumulation of the beta-catenin protein is a frequent event in human osteosarcoma.Int JCancer，2002，102:338-342.

8 Arnsdorf EJ，Tummala P，Jacobs CR.Non-canonicalWnt signaling and N-cadherin related beta-catenin signaling play a role in mechanically induced osteogenic cell fate.P Los One，2009，4:5388.