酸性肽对体外培养大鼠星形胶质细胞增殖的影响*

马红霞,周运恒,范列英,安玉会

1)同济大学附属东方医院检验科上海 200120 2)武警上海总队医院检验科上海 201103 3)郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 郑州 450001

△女,1975年11月生,硕士,主管技师,研究方向:老年痴呆的分子生物学及药物治疗,E-mail:mahx2004@126.com

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种神经系统退行性疾病,以老年斑、神经细胞纤维缠结和神经细胞丢失为主要病理改变[1],其病因及发病机制尚不清楚,目前尚缺乏有效的治疗手段。神经肽是具有神经信息传递和调控作用的一类物质,在中枢神经系统内分布广泛,参与机体多种功能的调节。An等[2-3]从牛脑组织中首次分离出一种新的酸性牛神经肽,并发现其可通过增加脑内蛋白质的合成,提高脑内抗氧化能力,减少脑内一氧化氮(NO)的生成,改善脑内能量代谢障碍,对血管性痴呆模型小鼠和 AD模型大鼠有良好的治疗效果。作者观察了酸性肽对体外培养的星形胶质细胞生长增殖的影响,报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Sigma公司),乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(北京中生北控公司),MTT(Sigma公司),二甲基亚砜、胰酶和多聚赖氨酸(Sigma公司),台盼蓝(郑州阳光公司), DMEM培养基(Gibco公司),胎牛血清(郑州真科生物有限公司)。

1.2 大鼠星形胶质细胞的培养与鉴定[4-5]取出生后2 d内的SD大鼠(郑州大学实验动物中心),无菌条件下断头取出大脑皮质部分,投入PBS中,仔细剔除中脑、嗅球、海马、脑膜及毛细血管等结构,进行星形胶质细胞的原代培养。取第 2代的星形胶质细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞,接种于预先经多聚赖氨酸处理的盖玻片上,3 d后,先用 0.01 mol/L PBS漂洗,再用PBS配制的40 g/L多聚甲醛固定,经含体积分数3%H2O2和体积分数10%甲醇的0.01mol/LPBS处理后,按照免疫细胞化学ABC染色方法进行GFAP抗血清(工作浓度为1:500)反应。

1.3 实验分组及样品的制备 将纯化培养的第 2代星形胶质细胞用2.5 g/L的胰酶消化成单细胞悬液,以 5×105mL-1接种于 12孔培养板中,每孔 1 m L。实验分 5组,每组设 7个复孔。无血清组(只加培养基不加血清)、胎牛血清对照组(加入含体积分数 20%的胎牛血清)、酸性肽低、中及高剂量组(分别加入37.5、75.0及150.0mg/L的酸性肽),分别培养 24、48及 72 h。实验终止后,分别将上清液移入无菌的EP管中,1 000 r/m in离心5 min,再将上清液分别移入另一无菌EP管,-20℃冷藏待测。底层细胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后用PBS配制成相同体积的细胞悬液。

1.4 细胞存活率检测 用玻棒蘸 1滴培养 24、48和 72 h的上述细胞悬液,每组 7个复孔,滴于血细胞计数板上,计算总细胞数。细胞用PBS轻洗2次,每孔滴PBS配制的4 g/L台盼蓝溶液200μL,混匀,滴于血细胞计数板上,3 min左右在倒置显微镜下观察,计数 400个相邻细胞中蓝染细胞(死亡细胞)个数。细胞存活率=[(总细胞数-蓝染细胞数)/总细胞数]×100%。

1.5 细胞上清液LDH含量测定 采用日立7170全自动生化分析仪测定各组细胞上清液中 LDH的含量。

1.6 细胞增殖率的检测 采用MTT法[6]。将纯化培养的第2代星形胶质细胞用 2.5 g/L的胰蛋白酶消化成单细胞悬液,以 5×105mL-1接种于 96孔板,按实验设计处理细胞后,每孔加入20μL 5 g/L的MTT,然后再放入CO2培养箱中继续培养4 h,小心吸去培养液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,振荡10min,以不加细胞培养液的空白对照孔调零,酶标仪检测492 nm的吸光度值,每组8个复孔。增殖率=(实验组吸光度值-对照组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。

1.7 统计学处理 运用SPSS 15.0处理数据。对不同时间点各组细胞存活率、增殖率及上清液中LDH含量的比较行单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 体外培养的星形胶质细胞及其鉴定 见图1。

图1 体外培养的星形胶质细胞及其鉴定A:传1代的星形胶质细胞;B:星形胶质细胞的鉴定(免疫细胞化学ABC,×200)。

2.2 各组细胞存活率比较 见表1。

表1 各组细胞存活率比较(n=7) %

2.3 各组细胞上清液中LDH含量比较 见表2。

表2 各组细胞上清液中LDH含量比较(n=7) U/L

2.4 各组细胞培养72 h后增殖率比较 见表3。

表3 各组细胞培养72 h后增殖率的比较 %

3 讨论

星形胶质细胞体内有一种特异性的标志蛋白GFAP。该实验中作者提取的神经细胞经GFAP免疫细胞染色鉴定证明其纯度大于 95%,能够达到研究的要求。

该研究结果显示,培养 24、48及 72 h后酸性肽各组细胞存活率几乎均高于相同条件的无血清组和胎牛血清对照组。培养 72 h后酸性肽各组细胞增殖率均高于无血清组和胎牛血清对照组,说明酸性肽对星形胶质细胞的生长有营养和保护作用。

LDH是一种胞内酶,广泛存在于各种组织细胞中,正常情况下释放很少,病理情况下细胞膜通透性增高或完整性丧失时,LDH漏出增加。因此,测定胞外LDH含量可以衡量细胞损伤的程度[7]。该实验结果显示,酸性肽各组培养上清中的 LDH含量都明显低于相应时间点的胎牛血清对照组,说明酸性肽对星形胶质细胞的损伤作用远远低于体积分数20%的胎牛血清。

综上所述,酸性肽对体外培养的大鼠星形胶质细胞的生长增殖具有一定的营养和保护作用。

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