醋酸铅对大鼠睾丸支持细胞活性及抑制素 BMRNA水平的影响＊

醋酸铅对大鼠睾丸支持细胞活性及抑制素 BMRNA水平的影响＊

苏晓东1),李春阳2),高慧艳1),赵士光3),陈小玉1)#
1)郑州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室郑州 450001 2)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州 450001 3)衢州市疾病预防控制中心衢州 324000
#通讯作者,女,1957年 11月生,硕士,教授,研究方向：生殖与发育毒理,E-Mail：chen-xiaoyu@zzu.edu.cn

醋酸铅;睾丸支持细胞;抑制素;大鼠

目的： 观察醋酸铅对体外培养大鼠睾丸支持细胞活性和抑制素B( INH B)mRNA水平的影响。方法：建立大鼠睾丸支持细胞体外培养模型,分别给予不同浓度 (0、10-8、10-7、10-6和 10-5mo l/L)的醋酸铅处理细胞,培养 24 h后采用MTT法测定细胞活性;同法分组,采用 RT-PCR检测 INH B mRNA的表达。结果：各组细胞活性比较,差异无统计学意义(F=2.451,P=0.064);各组细胞 INH B mRNA的相对表达量比较,差异有统计学意义 (F= 9984.370,P＜0.001),醋酸铅浓度在 10-8和 10-7mo l/L时,睾丸支持细胞细胞 INH B mRNA的表达水平低于对照组(P＜0.05)。结论：醋酸铅对大鼠睾丸支持细胞可能有毒性作用。

NH B)mRNA in Sertoli cellsof rats.Me thods：The Serto li cellswere allocated into 5 groups and given lead acetate at0, 10-8,10-7,10-6,and 10-5mo l/L,respectively.MTTMethod was used to observe the cell activity.The Serto li cellswere allocated as above,and the INH B mRNA levelwasMeasured by RT-PCR.Resu lts：The cell activity of Serto li cells had no significant difference among the 5 groups(F=2.451,P=0.064).The exp ression level of INH B mRNA had significant difference among the 5 groups(F=9984.370,P＜0.001),and the exp ression levels of INH B mRNA in 10-8and 10-7mo l/L groupswere higher than thatof contro l group(P＜0.05).Conc lus ion：Lead acetate cou ld affect the exp ression level of INH B mRNA in Serto li cells,which has toxic effects on the Serto li cells.

铅是人类最早开始使用的重金属之一。随着现代工业和交通业的迅猛发展,铅的大量广泛使用,使其已成为严重的环境污染物。铅能对机体多个系统和器官造成损伤,并能影响动物和人类的生殖功能[1-2]。睾丸支持细胞在生精过程中起着非常重要的作用,其重要产物抑制素 B(inhibin B, INH B)能反映睾丸支持细胞的功能状态[3]。作者观察了不同浓度醋酸铅对大鼠睾丸支持细胞活性及 INH B mRNA水平的影响,报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 18～20日龄普通级雄性 SD大鼠 4～6只,由河南省实验动物中心提供。DMEM/F12培养液 (Gibco公司),胎牛血清 (Hyc lone公司),胶原酶 Ⅰ(SigMa公司),胰蛋白酶(AMresco公司),HEPES培养基 (AMresco公司),二甲基亚砜 (DMSO,SigMa公司),其他试剂均为市售分析纯。目的基因 INH B(扩增产物大小为 253 bp)

＊河南省自然科学基金资助项目 0611045300上游引物 5’-TGCCCTGGATGGCTGTAT-3’,下游引物5’-TGTCCCTGTCCCAAGAGTAAG-3’;内参 GAPDH(扩增产物大小为 292 bp)上游引物 5’-TGTC CCTGTCCCAAGAGTAAG-3’,下游引物5’-CAGTCT TCTGAGTGGCAGTGAT-3’;均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 睾丸支持细胞的分离、纯化、培养与鉴定 参照文献[4]方法：颈椎脱臼法处死大鼠,体积分数75%乙醇消毒后取出双侧睾丸,用 D-Hank’s液洗净并剪碎至 1 mm3大小,加入 3 mL 2.5 g/L胰蛋白酶液消化 30 Min,离心后加入 2 mL 1 g/L胶原酶Ⅰ液消化 20 Min,100目不锈钢筛过滤。加入适量含血清的DMEM/F12培养液吹打混匀,调整细胞密度至 (2～4)×105mL-1,接种于 6孔板,35℃、体积分数 5%CO2饱和湿度下培养 48 h后,加入 20 mmo l/ L的 Tris-HCl低渗液纯化处理 5 Min。加入不含胎牛血清的培养基继续 48 h后,采用 Feu lgen染色法鉴定支持细胞。

1.3 睾丸支持细胞活性检测 采用MTT法。取细胞悬液,调整细胞密度为 (2～4)×105mL-1,每孔200μL接种于 96孔板。48 h后低渗纯化,继续培养 48 h,然后加入醋酸铅工作液,使终浓度分别为10-8、10-7、10-6和 10-5mo l/L,另设对照组 (加入培养液),每个浓度设 8个复孔。继续培养 24 h后取出培养板,每孔加入 5 g/L MTT溶液 20μL,在培养箱继续培养 4 h,中止培养,小心吸弃孔内的上清液,每孔加入 150μL DMSO,振荡 10 Min使蓝紫色结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上 492 nm波长下测定各孔吸光度(A)值。

1.4 睾丸支持细胞 INHBMRNA表达测定 采用RT-PCR方法。细胞染毒 24 h后终止,用 Trizo l试剂提取总 RNA,逆转录为 cDNA,以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：总体系 25μL。10× PCR Buffer2.5μL,dNTPMixture 2μL,上、下游引物各 1.0μL,Taq酶 0.2μL,cDNA模板 1.0μL,灭菌双蒸水 17.3μL。PCR反应条件：94℃预变性 5 Min;94℃变性 30 s,(IHN B 48℃,GAPDH 54℃)退火 45 s,72℃延伸 1 Min,循环 35次;72℃终延伸10 Min。取扩增产物在 20 g/L琼脂糖凝胶中电泳,应用图像分析仪测定灰度值,以 INH B与 GAPDH灰度的比值代表mRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理 运用 SPSS 12.0进行统计分析,采用单因素方差分析比较支持细胞活性和 INH B mRNA的表达水平,两两比较采用 SN K-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 睾丸支持细胞的鉴定 Feu lgen染色可见胞质呈网状,为绿色,核呈淡紫色,核仁区着色较浅,核仁两侧可见 2个深紫色的颗粒,为支持细胞特异的卫星核小体,与核仁呈三角形排列,证明培养细胞为支持细胞。

2.2 各组大鼠睾丸支持细胞活性和 INH B MRNA表达水平比较 结果见图 1、表 1。

表1 各组大鼠睾丸支持细胞活性和 INH B MRNA表达水平比较

图1 各组大鼠睾丸支持细胞 INH B MRNA的 RT-PCR测定结果

3 讨论

睾丸支持细胞能为生精细胞提供支架、参与血睾屏障,供给生精过程所需的能量及营养物质,同时能分泌数十种活性物质,如 INH、转铁蛋白、雄激素结合蛋白及生长因子等,参与生精细胞分化和成熟的调节,被称为是生精细胞的“保姆细胞”[5]。支持细胞的数量和功能正常对精子发生有至关重要的作用[6]。 INH是支持细胞分泌的一种糖蛋白类激素,属于转化生长因子β超家族中的一员,是由一个α亚基和一个β亚基通过二硫键构成的异质二聚体,由于β亚基有βA和βB 2种,因此 INH也有 INH A (α βA)和 INH B(α βB)2种形式。研究[7]发现,在成年男性血液循环中主要存在且具有生物学活性的是 INH B,它是评价睾丸生精功能最好最灵敏的直接指标。Monsees等[8]指出,对睾丸支持细胞有毒性的化学物质均能使其分泌 INH B的能力下降,因此,可以用支持细胞分泌 INH B的水平评价外源性化学物对支持细胞的毒性作用。

该研究结果表明,在 10-8～10-5mol/L浓度范围内醋酸铅对支持细胞活性无明显影响。在支持细胞活性不受影响的前提下,作者应用 RT-PCR法检测了醋酸铅对 INH B mRNA表达水平的影响,结果显示, 10-8和 10-7mol/L醋酸铅均可引起 INH B mRNA的表达水平降低,但随着剂量的升高, INH B mRNA的表达水平逐渐恢复正常,可能与醋酸铅浓度升高时支持细胞代偿性上调 INH B mRNA的水平有关。

总之,该研究证明醋酸铅能引起支持细胞 INH B表达水平的改变,但该研究是体外实验,并且只是在转录水平探讨了醋酸铅对 INH B mRNA表达的影响,对于体内实验和蛋白表达水平还有待进一步研究证实。

[1]Corpas I,CastilloM,MarquinaD,et al.Lead intoxication in gestational and lactation periods alters the developMent of Male rep roductive o rgans[J].Eco toxico l Environ Safe, 2002,53(2)：259

[2]刘欣欣,李宁,郑艳涛,等.母鼠孕哺期铅暴露对仔鼠学习记忆能力及神经反射的影响 [J].实用儿科临床杂志,2009,24(19)：1 519

[3]BassasA rnau L.Exp lo ration of testicu lar function[J].Endocrino lNutr,2009,56(1)：18

[4]Teng Y,XueW J,D ing XM,et al.Iso lation and cu lture of adu lt Serto li cells and their effects on the function of co-cu ltured allogeneic islets in vitro[J].Chin Med J(Engl), 2005,118(22)：1 857

[5]Petersen C,SoderO.The serto li cell：a hor monal target and ‘super’nurse for ger Mcells that deter Mines testicular size [J].Hor MRes,2006,66(4)：153

[6]李环,高久春,郭航,等.血清生殖激素水平与精子密度的关系[J].吉林大学学报：医学版,2009,35(3)：530

[7]Bergada I,Bergada C,Campo S.Role of inhibins in childhood and puberty[J].J Pediatr EndocrinolMetab,2001,14(4)：343

[8]Monsees TK,FranzM,Gebhardt S,et al.Sertoli cells as a target for rep roductive hazards[J].Andrologia,2000,32(4/5)：239

(2009-06-18收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of lead acetate on exp ression of inhibin B mRNA in rat Sertoli cells

SU X iaodong1),L I Chunyang2),GAO Huiyan1),ZHAO Shiguang3),CHEN X iaoyu1)

1)D epar tMen t of Toxico logy,Co llege of Public Hea lth,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou 450001 2)D epar tMen t of O ccupa tiona lMed icine,College of Public Hea lth,Zhengzhou Un iversity,Zhengzhou 450001

3)Cen ter forD isease Preven tion and Con tro l of Quzhou C ity,Quzhou 324000

lead acetate;Sertoli cell;inhibin B;rat

A im：To investigate the effects of lead acetate on the cell activity and the exp ression level of inhibin B (I

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