人 PTEN基因 RNA干扰及其 RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

人 PTEN基因 RNA干扰及其 RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

王玉梅1,2,3)△,盛光耀1)
1)郑州大学第一附属医院儿科郑州 450052 2)郑州大学第三附属医院儿内科郑州 450052 3)美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液系密苏里州 63110-1093
△女,1962年 11月生,博士研究生,主任医师,研究方向：小儿血液病 /肿瘤学,E-Mail：wangyuMei15@yahoo.com.cn

PTEN基因;慢病毒载体;RNA干扰;逃避 RNA干扰策略结构;脱靶效应

目的： 构建人 PTEN基因RNA干扰(RNA i)及其逃避RNA i策略结构(RESC)救援的慢病毒载体。方法：利用 Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的 PTEN基因 RNA i有效靶序列,设计并合成靶序列的 o ligoDNA,退火形成双链DNA,与经 XbaⅠ和 XhoⅠ酶切后的 pFLRu-GFP载体连接构建成 pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体。在此基础上,引入外源设计的 PTEN mRNA,与经 Eco RⅠ和BaMHⅠ酶切后的 pFLRu-U 6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人 PTEN基因 shRNA及其救援 cDNA同时表达的 RESC慢病毒载体 pFLRu-U 6-rrshPTEN。2者均转入到大肠杆菌 XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定。分别用 pFLRu-U 6-shPTEN、pFLRu-U 6-rrshPTEN与 pCMV-dR8.2ΔR和 pCMV-VSV-G质粒共转染 293T包装细胞,包装产生 2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度。结果：氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U 6前引物测序鉴定结果显示p FLRu-U6-shPTEN和 p FLRu-U 6-rrshPTEN均为阳性克隆,且 2种慢病毒的滴度分别为 6.6×105和 5.6×105p fu/mL。结论：成功构建出人 PTEN基因RNA i及其RESC慢病毒载体。有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究 PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体。

与张力蛋白同源的 10号染色体缺失的磷酸酶基因[1](phosphatase and tensin homo logue deleted on chromosoMe ten gene,PTEN),是具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,它的缺失和失活与多种肿瘤的发生发展有关[2-3]。RNA干扰 (RNA interference, RNA i)技术可高效、特异地下调目标基因的表达,在基因功能研究和基因治疗领域有着广阔的应用前景,为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具[4]。但是在 RNA i过程中常有“脱靶效应”的发生,从而造成实验假阳性结果[5-6]的出现。该研究旨在构建 PTEN基因的 RNA i及其逃避 RNA i策略结构[7](RNA i escape strategy construct,RESC)救援的慢病毒载体并进行鉴定,它有效地避免了因“脱靶效应”所造成的假阳性结果对实验的干扰,为 PTEN基因的功能研究提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料 pFLRu-GFP载体在 pB luescrip t(购自Invitrogen公司)基础上,加入绿色荧光蛋白 (GFP)、Flag-H is标签、血细胞凝集素和嘌呤霉素内部核糖体进入位点等构建而成。PTEN基因的慢病毒干扰片段、所用引物,采用 Invitrogen网站上的免费软件设计并由美国 Integrated DNA Techno logies( IDT)公司合成。高糖DMEM培养基、MEMA lpha培养基和胎牛血清 (FBS)购自 Gibco公司。质粒提取试剂盒,胶回收试剂盒,PCR扩增试剂盒,Op ti-MEM培养基,TRANSIT,pCMV-dR8.2ΔR,pCMV-VSV-G,限制性内切酶 XbaⅠ、XhoⅠ、B aMHⅠ和 Eco RⅠ,T4DNA连接酶,胰蛋白酶均购自 Invitrogen公司。鱼精蛋白购自 SigMa公司。293T细胞株购自 Invitrogen公司,由美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液学实验中心传代培养。大肠杆菌 XL10感受态细胞由美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液学实验中心制备。

1.2 PTEN基因 RNA i慢病毒载体的构建 试验过程包括 3个连续的步骤。第 1步 PCR用引物 5’-ACAGAATTCTAGAACCCCAGTGGAAAG ACGCGCAG-3’(正义链 U f1)、5’-GGTGTTTCGTCCTTTCCA CAAG-3’(反义链U r1),模板 pBS-hU 6-1,扩增出含hU 6启动子 (含 XbaⅠ酶切位点)的寡核苷酸片段(f1)。用 10 g/L TAE琼脂糖凝胶、凝胶纯化试剂盒回收预期 340 bp大小的 PCR产物片段。第 2步PCR使用配对引物 Cf1、C r1(表 1)扩增出能使PTEN基因沉默的 shRNA(含 XhoⅠ酶切位点)片段(f2)。用 120 g/L TAE聚丙烯酰胺凝胶纯化,回收80 bp的 PCR产物片段。第 3步 PCR用U f1、Cr1作引物,f1和 f2的混合物作模板,扩增出 U 6-shPTEN片段,用 10 g/L TAE琼脂糖凝胶、凝胶纯化试剂盒回收 420 bp大小的 PCR产物片段 (f3)。之后用pFLRu-GFP作载体,f3作为插入片段,用 XbaⅠ/ XhoⅠ酶切,分别回收并纯化 9000及 420 bp片段。用 T4DNA连接酶连接后,将连接产物转化到大肠杆菌 (E.co li)XL10感受态细胞,涂布氨苄青霉素抗性 (100 Mg/L)平板,37℃过夜培养。对阳性克隆提取质粒;用 XbaⅠ/XhoⅠ/B aMHⅠ酶切对质粒初步鉴定,选择有 9000、1 200和 420 bp片段的质粒测序。U 6前引物测序验证,序列为 5′-GTTGGCGAGT GTGTTTTGTGAAG-3′。

1.3 PTEN基因 RESC救援慢病毒载体的构建

通过 3步 PCR从人类 PTEN基因的 cDNA扩增出PTEN蛋白的全长编码区。前 2步 PCR分别用CF1/CR1和 CF2/CR2(表 1)作引物,其中引物 CR1 和CF2包含 4个点同义突变,人 PTEN cDNA(Thermo Scien tific公司,美国)作模板扩增出对应 shRNA位置有同义突变的、大小为 650 bp(F1)和 560 bp (F2)的 2段 MRNA片段,用 10 g/L TAE琼脂糖凝胶回收 F1和 F2。第 3步 PCR用 CF1和 CR2作引物,F1和 F2的混合物作模板扩增出在 PTEN的 shRNA序列对应的位置含有同义突变的突变后的全长片段 (F3),回收预期为 1 200 bp左右 PCR产物片段。pFLRu-U 6-shPTEN作载体,F3为插入片段,用上述方法把 F3片段亚克隆到 pFLRu-U 6-shPTEN质粒的 Eco RⅠ/B aMHⅠ酶切位点。阳性克隆经XbaⅠ/XhoⅠ/Eco RⅠ/BaMHⅠ酶切初步鉴定,选择有 9000、1 200和 420 bp片段的质粒测序鉴定。测序上游引物：5′-GTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAG-3′;测序下游引物：5′-CTGAGGATCCTTTGATT GAAGAGCTTTCTTTATG-3′。

1.4 慢病毒的包装和滴度测定 用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,细胞密度为15×106L-1时重新接种于直径10cm的细胞培养皿,37℃、体积分数 5%CO2培养箱内培养,细胞达 70%融合时进行转染。用Op ti-MEM培养基,在 TRANSIT介导下,使用慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2ΔR和pCMVVSV-G混合物(质量比8：1混合)分别与慢病毒质粒 pFLRu-U 6-shPTEN和 pFLRu-U 6-rrshPTEN共转染 293T细胞;转染后24 h用含体积分数 10%FBS 的MEMA lpha培养基对细胞进行换液处理;转染后48 h收集细胞上清,1 200 r/Min离心5min,然后使用0.45μm的过滤器过滤上清液。慢病毒贮液梯度稀释 (10-1～10-6)。剩余病毒-80℃保存备用。DMEM培养液重悬 N IH3T3细胞至 4×106L-1,在96孔板每孔中加100μL重悬细胞、45μL病毒颗粒稀释液,感染细胞,37℃温育8 后,更换含体积分数10%FBS的DMEM培养液继续培养。倒置荧光显微镜下检测 GFP表达量,病毒滴度为表达 GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。

2 结果

2.1 双链寡核苷酸的合成 将针对目标基因PTEN特异性的干扰单链寡核苷酸行退火处理,得到双链寡核苷酸产物(图 1)。

图1 PTEN基因干扰片段双链寡核苷酸电泳图M：Marker;1：PTEN基因的干扰片段。

2.2 pFLRu-U6-shPTEN和 pFLRu-U6-rrshPTEN阳性克隆测序鉴定 测序及在 GenBank数据库B last分析与其他基因的同源性后,证实所得结果与实验要求的 DNA序列完全一致,提示 pFLRu-U 6-shPTEN和 p FLRu-U 6-rrshPTEN均为阳性克隆。

2.3 慢病毒载体的包装及滴度测定 测得 pFLRu-U6-shPTEN和 pFLRu-U6-rrshPTEN2种慢病毒的病毒滴度分别为6.0×105和5.0×105pfu/mL。说明有大量质粒转入 293T细胞,病毒成功包装。

3 讨论

PTEN基因[1]定位于染色体 10q23.3,由 9个外显子和 8个内含子构成,其 cDNA序列包含由1 209个核苷酸组成的开放阅读框架,编码 403个氨基酸组成的蛋白质,其编码产物具有双重磷酸酶活性。PTEN作用于AKT信号传导通路的中心环节,通过脂质磷酸酶活性抑制 PI3K的磷酸化,阻断AKT/蛋白激酶B(PKB)途径,在胞质细胞信号传递诱导凋亡、介导 G1期停滞、影响基因的表达、抑制细胞迁移、浸润和整合素介导的细胞铺展及局部黏附等过程中起着重要作用[8]。它通过抑制 pMAK细胞信号传导途径抑制细胞生长分化[9]。因此 PTEN在正常表达时可抑制肿瘤细胞生长、迁移及浸润。PTEN的突变或杂合丢失可导致 PTEN编码蛋白表达缺失,从而导致某些恶性肿瘤的发生[2-3]。

RNA i由于能够高效率、特异性地下调靶基因表达,已被证明是一个在内源性基因功能研究领域的有效工具,已成为分子生物学研究的常规技术。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体,以H IV-1为基础发展而得[10-11],能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞,还能将病毒的遗传物质整合到宿主细胞的基因组,感染后细胞可以稳定持续表达目的基因[12-13],是基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。然而随着 RNA i技术的应用,越来越多的证据[5-6]表明“脱靶效应”在 RNA i中广泛存在,它使实验出现假阳性结果,直接影响了实验结果的准确性。为了避免“脱靶效应”的干扰,作者在研究中引入救援机制,根据氨基酸的简并性,在核苷酸水平上改变靶基因,使其基因表达的天然蛋白编码不变,同时又能妨碍 RNA i沉默,从而允许救援。构建出的RESC救援慢病毒载体引入RNA i实验中,如果能恢复由 RNA i引起的变化,则可以排除因 shRNA的脱靶效应所引起的假阳性结果。

该研究中,作者用 PTEN基因作为靶基因,系统地论述了构建 RNA i及其 RESC救援慢病毒载体体系的实验过程。构建 RNA i慢病毒载体时,根据Tusch l[14]设计原则,设计合成了 1对能表达 PTEN基因的 shRNA单链寡核苷酸,GC含量在 35%～55%。中间添加 Loop结构 (TTCAAGAGA)。以碱基“G”开始,到“TTTTT”终止,使质粒转染到细胞后转录从“G”开始。通过运用 2个重叠的单链寡核苷酸的 PCR合成了 shRNA的DNA模板。然后将这个基因片段与 hU 6启动子融合并克隆到慢病毒载体 pFLRu-GFP中,从而得到 pFLRu-U6-shPTEN载体。构建 RESC救援慢病毒载体时,针对 PTEN基因的mRNA序列对应的 shRNA位置引入 4个点同义突变,使 shRNA不能作用于这种“外源”设计的mRNA。同义突变(CR2)灭活 PTEN基因 cDNA的终止密码子。在其两端分别加入酶切位点,以便基因操作及识别。把这个具有抗 shRNA的基因片段与 GFP融合后亚克隆到慢病毒载体 pFLRu-U 6-shPTEN中,得到一个载体内既有 shRNA的表达,又有抗RNA i的 cDNA表达的 RESC救援慢病毒载体pFLRu-U 6-rrshPTEN。

该研究中所开发构建的 RNA i及其 RESC救援慢病毒载体体系有以下优点：①该研究所使用的慢病毒载体可转染体内非分裂期、休眠期细胞或体外生长阻止细胞;带有目的基因的遗传物质能够整合到宿主基因组中,同时能够稳定表达[13]。②siRNA通过细胞内转录生成,而不是化学合成或体外转录。这是一个在 RNA i表达中 siRNA合成的便捷的方法。③抗 siRNA目的基因的 cDNA与 shRNA表达在同一个载体中,用来恢复实验中由 RNA i引起的表型改变。虽然作者的慢病毒载体体系并没有消除潜在的“脱靶效应”,它却能够明确判断实验中表型改变是由 siRNA诱导沉默引起或所谓的“脱靶”的效果。因此,在该研究中提出的构建 RNA i及其RESC救援慢病毒载体的体系在基因功能研究中具有普遍的适用性。

总之,作者通过酶切、测序等筛选出 PTEN基因RNA i的有效靶序列后,应用 293T细胞作为包装细胞,在包装后产生了高滴度的病毒颗粒,同时表达报告基因 GFP。结果表明,成功构建了含有 GFP报告基因的 PTEN基因的 RNA i慢病毒载体及其 RESC救援慢病毒载体,为进一步研究 PTEN基因功能并探讨其在细胞迁移过程中的机制奠定了基础。

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(2009-12-02收稿 责任编辑姜春霞)

可能已具有了某种人格特质和生物学基础,从而成为焦虑障碍发生的易感素质,在生活事件和不良社会环境共同作用下,导致了焦虑障碍的发生。

致谢 感谢香港中文大学张妙清教授、中国科学院心理研究所张建新教授提供了量表和悉心指导!

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(2009-06-12收稿 责任编辑王 曼)

Construction and identification knockdown and RESC concurrent rescue of RNA i lentiviral vector on human PTEN gene

WANG YuMei1,2,3),SHENG Guangyao1)

1)D epartMen t of Ped ia trics,the First Affilia ted Hospita l,Zhengzhou Un iversity,Zhengzhou 450052 2)D epartMen t of Ped ia trics,the Th ird Affilia ted Hospita l,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052 3)D ivision of HeMa tology,Schoo l of Med icine,W ashing ton University in St.Louis,MO 63110-1093

PTEN gene;lentiviral exp ression vector;RNA interference;RNA interference escape strategy construct; off-target effect

A im：To construct the lentiviral exp ression vectors of huMan PTEN fo r RNA i and for concurrent rescue of RNA i escape strategy construct(RESC).Me thods：PTEN shRNA sequence of huMan was designed by on-line designer software on Co rp. Invitrogen.A fter synthesis and annealing,doub le strand o ligonuc leo tides(dso ligoes)that d igested w ith XbaⅠand XhoⅠwere cloned into the pFLRu-GFP p lasMid and lentiviral exp ression vector of pFLRu-U 6-shPTEN was obtained.Based on pFLRu-U 6-shPTEN,exogenousmRNA of PTEN were d rawn into RNA i,and the vector of coMbining the exp ression of shRNA and rescue cDNA in the saMe vector pFLRu-U 6-rrshPTEN were gotten after being digested w ith Eco RⅠand BaMHⅠenzyMes.Theywere then transfor Med into cheMically competent E.coli XL10b lue bacteria.And after identification by sequencing and digestion,293T cell line was transfected by above positive recoMbined p las Mids and len tiviral packingMaterials pCMV-dR8.2ΔR and pCMV-VSV-G p lasMids.Theywere incubated for 48 to 72 h in a 37℃,5% CO2incubator.Cu lture supernatantwas harvested and stored at-80℃,then the virus titerwas deter Mined by serial dilution assay.Resu lts： It was showed that all the p las Mids,recoMbinant vectors pFLRu-U 6-shPTEN and pFLRu-U 6-rrshPTEN,were positive c lone vecto rs after screening positive c lones by aMp icillin,d igested and sequenced by the use of p riMer for ward ofU 6 p riMer.Conc lusion：Lentiviral shRNA exp ression vector and RESC vecto r coMbining the exp ression of shRNA and concurrent rescue cDNA in the saMe vector are successfu lly constructed.They obviate to Misinterp retation of phenotypes as a result of false-positive responses by off-target effectively and p rovide the stable transfection vectors for research on PTEN gene.

�图分类号 Q782