粘细菌A HB103-1发酵生产抗肿瘤活性物质

徐 凤, 陶文沂＊,2

(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)

粘细菌是一类具有复杂多细胞形态的革兰氏阴性菌,它能产生丰富的活性次级代谢物,这些物质不但结构新颖,而且具有其他微生物的代谢物所不具备的活性作用机制[1],尤其是其中的纤维堆囊菌属活性物质的产率更高,达96%。1987年,在纤维堆囊菌中发现与紫杉醇具有相同作用机制的epothilones之后,它更激起人们广泛的研究兴趣[2]。AHB103-1也是一种纤维堆囊菌,作者重点研究了它发酵生产抗癌活性物质的工艺条件和培养基组成,并对它的形态和理化特征也进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 纤维堆囊菌AHB103-1,作者所在实验室保藏菌株。

1.1.2 培养基

1)种子培养基[3-4](组分 g/L):土豆淀粉10.0,葡萄糖2.0,酵母粉2.0,脱脂奶粉4.0。

2)发酵培养基:氮源优化培养基(组分g/L):玉米淀粉12.0,各种氮源6.0,甘油5.0,XAD-16大孔树脂20.0。

3)碳源优化培养基(组分 g/L):各种碳源12.0,酵母粉 6.0,甘油 5.0,XAD-16大孔树脂20.0。

4)碳氮比优化培养基(组分 g/L):玉米淀粉12.0,酵母粉 7 个水平(2、4、6、8、10、12、15),甘油5.0,XAD-16大孔树脂20.0。

5)α-CEV Y/4 平皿培养基(组分 g/L):α-纤维素 1.0,安琪活性干酵母 2.5,CaCl21.0,琼脂15.0。

6)各种碳源平皿培养基(组分g/L):碳源(蔗糖、麦芽糖、木糖、纤维二糖、半乳糖、马铃薯淀粉、山梨糖、果糖、α-纤维素、甘露糖)10.0,KNO35.0,琼脂15.0。

7)葡萄糖平皿培养基(组分g/L):葡萄糖分别为 10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0,KNO35.0,琼脂15.0。

8)硫铵平皿培养基(组分 g/L):马铃薯淀粉10.0,硫铵 5.0,琼脂 15.0。

除α-CEV Y/4平皿培养基外,以上所有培养基均额外添加以下无机物质(组分g/L):CaCl21.0,MgSO4·7H2O 1.0,Fe(Ⅲ)-Na-EDTA 0.008。

以上各种培养基均用10%KOH调p H至7.2,121℃灭菌20 min。

1.1.3 活性物质筛选培养基 10%小牛血清,90%RPMI1640,2 mmol/L L-谷氨酰胺,100 U青霉素和100 U的链霉素。

1.1.4 肿瘤细胞株 人肝癌细胞 Hep G 2,江南大学生物制药系分子药理实验室惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 待测活性样品的制备 取树脂的甲醇提取液200μL置于恒重的离心管中,于45℃真空干燥至恒重,用20μL DMSO溶解样品。

1.2.2 细胞毒活性测定 采用MTT法。取对数生长期的 Hep G2癌细胞,配制成单细胞悬液,每孔8 000个接种于96孔细胞培养板。37℃培养24 h后加样,每种样品取5μL,用培养液稀释到1 mL后加入96孔板,每孔加200μL含样品的培养液,设4个平行孔。继续培养48 h后,各孔再加入20μL 5 mg/mL MTT液,继续培养4 h,弃上清液,每孔加200μL DMSO,振荡10～20 min,570 nm波长测定A值,重复3次,计算药物对细胞的抑制率[5-6]。

1.2.3 细胞毒作用的显微拍照 取对数生长期的Hep G2癌细胞,调细胞浓度1×105个/mL,加入细胞培养瓶中。饥饿培养24 h后,换正常培养基再培养24 h,然后分别加入样品,37℃培养24、48 h后显微拍照[7-8]。

1.2.4 发酵工艺条件的优化 根据单因素实验的结果,利用L18(36)正交表对发酵时间、起始p H值、发酵温度、接种种龄、摇瓶装液量、摇床转速等影响比较显著的发酵工艺条件进行优化,结果见表1。

表1 发酵条件的正交实验因素和水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions

2 结果与分析

2.1 粘细菌的形态及生理生化特征

粘细菌AHB103-1为末端钝圆的杆状菌,外有一层黏液状荚膜包裹,无鞭毛,见图1。透射电镜下营养细胞大小为0.8～1.0μm×2.5～3.0μm。在α-CEV Y/4平皿培养基上菌落为灰白色,呈放射状生长,菌落直径达5～7 mm,有少量黏液产生。这种菌在不同培养基上生长形态差异很大,在各种糖类较丰富的培养基上均发育为乳白晶莹的菌落,上有一层透明的黏液,发育至5～6 d时,甘露糖、马铃薯淀粉培养基上黏液明显变黄,菌开始聚集,标志着开始形成子实体。其他几种糖类培养基上未观察到聚集现象。而在碳源匮乏的培养基(葡萄糖≤0.2 g/dL)或者难利用的培养基(α-纤维素)上,菌落皆米白,不透明,没有黏液产生,菌不聚集。由此可知,虽然AHB103-1的子实体是在营养快耗竭时产生,但那些本来就营养匮乏的培养基也不容易形成子实体。那些透明的黏液可能是菌聚集的必要条件,粘细菌可能是通过这些黏液来运动的,而黏液的形成与基质中糖的质量浓度密切相关。粘细菌AHB103-1的生理生化特征见表2。

图1 粘细菌AHB103-1的不同形态特征Fig.1 Different morphological features of myxobacteria AHB103-1

表2 粘细菌AHB103-1的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical features of myxobacteria AHB103-1

2.2 粘细菌AHB103-1发酵条件的研究

2.2.1 碳氮源的优化 图2比较了不同氮源对总活性的影响。以酵母粉为惟一氮源时,总抑制率最高,2 mL发酵液所含的活性物对肿瘤细胞的抑制率达84.52%,花生饼粉次之,总抑制率为76.85%。无机氮源氯化铵、硫酸铵、KNO3为惟一氮源时总抑制率明显低于各种有机氮源,其中硫酸铵的总抑制率仅为 6.07%。以 KNO3为惟一氮源时,菌AHB103-1可以良好生长,但其总活性却比各种有机氮源低得多。可能是因为各种有机氮源含有活性物质的前体或促进因子。

图3比较了不同碳源对总活性的影响。以玉米淀粉为惟一碳源时,总抑制率最高,2 mL发酵液所含的活性物质对肿瘤细胞的抑制率达74.68%。α-纤维素次之,总抑制率为73.72%。而葡萄糖为惟一碳源时,活性物含量最低,仅为38.13%。由此可知,缓慢利用的碳源更适合用来生产抗肿瘤活性物质。

图2 氮源对总抑制率的影响Fig.2 Influence of carbon sources on the total inhibition rate

图3 碳源对总抑制率的影响Fig.3 Influence of carbon sources on the total inhibition rate

图4比较了不同碳氮比对总活性的影响。当氮源质量浓度由2 g/L升高至6 g/L时,总抑制率也相应由47.55%迅速增加至85.07%,但氮源质量浓度由6 g/L继续增至15 g/L时,总抑制率变化很小。

图4 碳氮比对总抑制率的影响Fig.4 Influence of C/N on the total inhibition rate

因此,氮源选择酵母粉,碳源选择玉米淀粉,碳氮比选择12∶6时较有利于抗肿瘤活性物质的产生。

2.2.2 发酵工艺条件的优化 发酵工艺条件的优化见表3。

表3 发酵条件优化正交实验结果及极差分析Tab.3 Rusults and range analysis of orthogonal experiment for fermentation conditions

根据极差R的大小排出各因素作用的主次次序为A>D>C>E>B>F,即发酵时间>接种种龄>发酵温度>500 mL摇瓶装液量>起始p H值>摇床转速,发酵时间和接种种龄对总活性的影响最为显著。优化后的发酵工艺条件为A1B3C2D2E3F2,即发酵时间 7 d,起始 p H 7.4,发酵温度30℃,接种种龄4 d,500 mL摇瓶装液量125 mL,摇床转速150 r/min。

2.2.3 前体物质和微量元素的影响 氨基酸作为菌体蛋白质合成的底物,影响着菌的生长和次级代谢产物的合成。图5研究了不同质量浓度的氨基酸对总活性的影响。当添加量为5 mg/L时,Ala(丙氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gly(甘氨酸)相对空白组均对总活性有大幅度的提高,其中Ala对总抑制率提高幅度最大,达34.63%。而添加5 mg/L的 Trp(色氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Tyr(酪氨酸)时 ,总活性反而下降,添加 Trp总活性下降最明显,达89.80%,可能低质量浓度的 Trp、Phe、Tyr对活性物的产生有抑制作用。当添加量升至10 mg/L时,Gly、Glu、Ala、Thr组的总活性均有下降,其中 Gly组下降的幅度最大,当质量浓度由5 mg/L提高到10 mg/L时,总抑制率下降了59.05%,比空白组低48.37%;而Ala组相对空白组对总活性仍有明显的促进作用。当质量浓度由5 mg/L提高到10 mg/L时,Trp组的总抑制率提高了10.84倍,相对空白总活性提高了27.65%;Tyr组的总抑制率提高了1.68倍,相对空白总活性提高了38.17%。因此 ,培养基中添加 5 mg/L Gly、Glu、Ala,10 mg/L Trp、Tyr对活性物的产生会有明显的促进作用。

图5 氨基酸对总抑制率的影响Fig.5 Influence of amino acid on the total inhibition rate

无机盐和微量元素可能影响菌体酶系的作用从而影响菌体内的许多生物合成途径,因而可能对活性物质的产生有一定的影响,结果见图6。Li-SO4、MnCl2、Na2MoO4、NaH2PO4对总活性均有明显的提高,其中 NaH2PO4提高的幅度最大,达38.34%。而 K2HPO4、CuSO4、ZnSO4均对总活性有强烈的抑制,总活性分别下降了 97.66%、96.48%、96.84%。因此,在培养基中添加 1.0 mg/L的 LiSO4、MnCl2、Na2MoO4和 NaH2PO4有利于总活性的提高。

图6 氨基酸对总抑制率的影响Fig.6 Influence of inorganic salts on the total inhibition rate

2.3 活性物质对肿瘤细胞形态的影响

进一步研究了 AHB103-1的代谢产物对Hep G2形态的影响,结果见图7。加药24 h后,加药组相对空白组的细胞数目明显减少,活性物对细胞的生长表现出明显的抑制作用,有少量细胞开始凋亡,悬浮在培养液中,但相对未加药时活细胞总数基本没变。继续培养至48 h时,培养液中大量细胞开始凋亡,活细胞很少,少量存活的细胞形态也有明显的改变,细胞变得肿胀,明显拉长。而对照组细胞饱满,贴壁生长良好,细胞数量相对0、24 h明显增加。

图7 加样前后肿瘤细胞形态的变化Fig.7 The morphological change of tumor cell before and after adding sample

3 结 语

粘细菌AHB103-1可以利用蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖,不能利用D-果糖、L-山梨糖、D-木糖。能在以硫铵和 KNO3为惟一氮源的琼脂平皿上发育为菌落。在不同的固体培养基上形态差别较大,在各种糖类较丰富的培养基上均发育为乳白晶莹的菌落,上有一层透明的黏液,而在碳源匮乏(葡萄糖≤0.2%)或者难利用(α-纤维素)时,菌落皆米白,不透明,没有黏液产生,菌不聚集。

以对人肝癌细胞 Hep G2的总抑制率为选择指标时,碳源选择玉米淀粉,氮源选择酵母粉,碳氮比选择12:6,培养基中添加5 mg/L Gly、Glu和Ala,10 mg/L Trp和 Tyr,1.0 mg/L的LiSO4、MnCl2、Na2MoO4和NaH2PO4对活性物质的产生有明显的促进作用。优化后的发酵工艺条件为:发酵时间7 d,起始p H 7.4,发酵温度30 ℃,接种种龄4 d,500 mL摇瓶装液量125 mL,摇床转速150 r/min。

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