高效液相色谱法测定烟草底料中低聚糖的含量

董伟

(红塔烟草(集团)有限责任公司技术中心,云南玉溪653100)

烟草底料产品中的低聚糖主要由水苏糖、棉籽糖和蔗糖3种低分子糖组成,棉子糖又称蜜三糖,是由半乳糖以α-1,6糖苷键与蔗糖的葡萄糖基连接所形成;水苏糖为四糖,是由棉子糖的半乳糖以α-1,6糖苷键与半乳糖连接而成。

目前,低聚糖的测定方法,以纸层析法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法为主,除液相色谱外,以上方法普遍存在样品前处理复杂、灵敏度低、杂质干扰大等缺陷。近些年来,高效液相色谱法并配以氨基色谱柱已较为普遍,该法样品前处理简单并能直接测定,还可减少糖的损失或偶然误差。但是,样品中还原糖易与氨基色谱柱中固定相成分发生化学反应,从而导致色谱柱使用寿命大大缩短,另外,该法使用乙腈配制流动相,大大增加了分析测试成本。作者选用Waters Sugar Pak1钙型阳离子交换色谱柱,以纯水作为流动相,研究建立了低聚糖的测定方法,并将其应用于烟草底料中蔗糖、棉籽糖和水苏糖的分析测定。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Waters 600高效液相色谱仪,配有Waters600四元输液泵,2410示差折光检测器,7725i进样阀,Empower2色谱工作站;Waters Sugar Pak1钙型阳离子交换色谱柱(6.5 mm×300 mm),Sep-Pak Alumin Cartridges保护柱;Milli2Q50超纯水仪处理后的纯水;EDTA钙钠:色谱级;蔗糖、棉籽糖、水苏糖标准样品,Sigma公司产品。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取250 mg水苏糖、棉籽糖和蔗糖,以纯水溶解并定容至10 mL,得到浓度为25 mg/mL的储备液;然后分别配制成3种组分浓度均为1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL 的标准混合溶液 ,4℃冰箱中保存。

1.3 样品的制备与测定

准确称取烟草底料产品1 g左右至10 mL容量瓶中,加入5 mL体积分数70%乙醇,超声波辅助浸提10 min,以无水乙醇定容至刻度,振摇,取上清液用0.45μm有机相微孔膜过滤,滤液供 HPLC分析。

2 结果与讨论

作者选用 Waters Sugar Pak1色谱柱,该色谱柱采用Ca2+型阳离子交换树脂作为填料,该填料使用聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物做骨架,由于高聚物的多孔特性,具有体积排阻的分离机理,使得样品中的Ca2+物质先被洗脱出来,物质后被洗脱出来。此外,Sugar Pak1色谱柱还具有配位交换作用,糖分子端基异构碳上所带羟基可被去质子化后带上强的负电荷,这些负电荷与色谱柱的树脂表面金属离子Ca2+离子所带的正电荷之间的相互作用可使糖分子在色谱柱上保留,并在洗脱时根据保留性质的强弱达到分离。通过Sugar Pak1色谱柱的双重分离机理,可使烟草制品低聚糖样品的糖组分得到分离,所以该实验选用Sugar Pak1色谱柱。

2.1 检测器的选择

与紫外可见吸收检测器(UVD)相比,示差折光检测区(RID)的灵敏度较低,待测组分在紫外光区无特征吸收峰,且待组分在样品中的含量较高,可选用示差折光检测器检测。

2.2 流动相的选择

Waters Sugar Pak1钙型阳离子交换柱一般以水作流动相,水中加入少量EDTA钙钠可减少柱材料上的钙离子流失,延长柱的寿命[1];作者考察了流动相中加入体积分数5%甲醇、乙腈及四氢呋喃等亲水性有机溶剂作调节剂对分离的影响。结果显示,加有机溶剂对分离并无明显改善作用,故实验选用0.05 g/L EDTA钙钠水溶液作为流动相。

2.3 柱温的选择

在室温(18～25℃)下,低聚糖组分分离度较低,峰型较差,且色谱柱压力较大,容易损伤色谱柱。实验表明,柱温保持在70～90℃之间均可使几种组分得到较好的分离且色谱柱的压力较小,本实验柱温控制为85℃。

2.4 色谱条件的最终确定

根据以上实验最终确定色谱条件。在此色谱条件下将水苏糖、棉籽糖和蔗糖混合标准溶液进样,得到标准混合溶液色谱图1。

图1 棉籽糖、水苏糖和蔗糖色谱图Fig.1 Chromatograms of oligosaccharides standard solution

2.5 线性关系、检测限、回收率的考察

以浓度分别为 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL低聚糖标准品工作液进行检测,每个浓度重复3次,计算平均值。将3种低聚糖峰面积对其相应浓度进行线性回归计算,得出相关系数r,结果见表1。图1为低聚糖混合标样的色谱图,从中可以看出,3种低聚糖能够在15min以前全部洗脱出来,并且分离度良好。由表1可见,3种低聚糖的峰面积与其浓度呈现线性关系(r>0.99),其中3种糖的相关系数都在0.9993～0.9997之间,说明在设定的浓度范围内线性关系良好;通过分析稀释后的标准品储备液,以3倍信噪比(S/N)计算检测限;样品平行测定5次,考察方法精密度。结果见表1。

样品通过添加不同质量浓度(1.0、3.0、5.0 mg/mL)3种低聚糖混标进行回收试验,基质及各加标水平样品平行测定3份,以外标法进行定量,并计算3个加标水平下的平均回收率,结果如图2及表2所示。3种低聚糖的平均回收率为96.9%～103.5%。

2.6 样品的测定

采用本实验建立的提取、分析方法,分别就烟草底料产品中低聚糖含量进行了测定,并计算出低聚糖的含量,结果如表3所示。

表1 HPLC法检测3种低聚糖的回归方程、相关系数及检出限Tab.1 Regress equation,r and detection limits of oligosaccharides detected by HPLC

表2 3种低聚糖的回收率测定Tab.2 Recovery tests for three kinds of oligosaccharides

图2 烟叶底料样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of tobacco casing materials

表3 低聚糖 HPLC测定结果Tab.3 Results of oligosaccharides detected by HPLC

3 结 语

高效液相色谱法采用Waters Sugar Pak1钙型阳离子交换色谱柱测定烟草底料产品中低聚糖含量,能使3种低聚糖在15 min内良好分离。该法重现性好,灵敏度高,能够快速测定烟草底料产品中低聚糖的含量,可推荐用于卷烟加料工序或香精香料品质控制工序过程中的常规分析测定。

[1]Kolwkar T G,Keskav V S.Determination of Sugars in Sugar Beet with High Performance Liquid Chromatography[J].International Sugar Journal,1998,192(1):164.