鲢鱼骨骼肌轻酶解肌球蛋白基因的cDNA克隆

王玲军, 陶妍, 党静, 王孙勇

(上海海洋大学食品学院,上海201306)

在鱼类肌肉蛋白质的组成中,肌球蛋白约占肌原纤维蛋白的50%以上,它主要决定了鱼肌肉蛋白质的加工适性。肌球蛋白分子含有两个相对分子质量约200 000的重链亚基和4个相对分子质量约20 000的轻链亚基,每个重链的氨基端形成一个球状的头部(S1)和颈状结构(S2),余下的羧基端形成具α-螺旋结构的被称之为轻酶解肌球蛋白(light meromyosin,LMM)的尾部;两对轻链分别非共价地结合在重链的颈部[1]。肌球蛋白分子的头部具有ATPase的活性;而LMM具有使肌球蛋白在生理条件下形成丝状的能力,它的结构性质在很大程度上决定了鱼肌肉蛋白质的凝胶形成特性[2]。

自从1990年 Gerlach等[3]首次报道了鲤鱼(Cy prinus carpio)肌球蛋白重链基因的多样性后,Kikuchi等[4]进一步证明了鲤鱼肌球蛋白重链属于“多基因家族”。3种与驯化温度相关的肌球蛋白重链同工型基因从温度驯化的鲤鱼骨骼肌中被分离到,并且这些同工型基因伴随驯化温度的表达模式也被确定[5];近年来,3种草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌球蛋白重链同工型基因也被分离,它们之间在LMM的一级结构上展现了明显的差异[6-7]。

综观世界淡水渔业的发展,低成本、高产量的低值淡水鱼占淡水鱼总产量的50%以上[8]。鲢鱼(Hy pophthalmichthys molitrix)属我国淡水鱼资源中具有代表性的鱼种之一,具有低值、高产的特点,因此也是加工利用的主要对象。为了探明鲢鱼肌肉蛋白质的加工适性,对来自不同季节的鲢鱼骨骼肌肌球蛋白Ca2+-A TPase的热稳定性和凝胶形成特性进行了测定和比较,发现春、夏季鲢鱼肌球蛋白的热稳定性明显优于秋、冬季鲢鱼的[9,10],并且它们在凝胶形成模式上也不同[11]。然而,迄今为止,国内外关于鲢鱼肌球蛋白分子水平上的研究报道很少。据此,作者以夏季和冬季鲢鱼为研究对象,对编码其骨骼肌LMM的部分基因进行cDNA克隆,以期分离不同的肌球蛋白重链同工型基因,并比较不同同工型之间在LMM的一级结构氨基酸组成上的差异,初步探明鲢鱼肌球蛋白的功能性质发生季节性变化的分子机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲢鱼(体质量730 g,体长40 cm),取自上海市青浦区养殖场,于2005年8月和2006年1月购自上海市图们路农贸市场,分别作为夏季和冬季的实验材料。鲜活鲢鱼运至实验室后,用钝器击毙,立即取其背部白色骨骼肌切成1 cm×1 cm×1 cm见方小块,用液氮快速冻结后,保存于-80℃冰箱待用。

1.2 总RNA提取和第一股cDNA合成

取-80℃保藏的鲢鱼肌肉约0.4 g于50 mL离心管中,立即加入 Trizol试剂(100 mg∶1 mL)(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA),用高速组织捣碎机处理2～3 min;取1 mL捣碎液于1.5 mL离心管中,28℃下静置5 min,加入0.2 mL氯仿,来回振荡15 s,28℃下放置2～3 min;采用高速冷冻离心机离心15 min(4℃,11 900g);上清液转移至新的离心管中,加入0.5 mL异丙醇,28℃下静置10 min,离心10 min(条件同上);沉淀加75%酒精1 mL,离心15 min(4 ℃,≤7 500g);弃去上清液,沉淀在铝箔上自然干燥 30 min后,溶解于10μL DEPC·H2O中,-80 ℃保存。

第一股cDNA的合成使用Super RT Kit(Invitrogen Corp)。2μL总 RNA、5μL AP通用引物(Adapter Primer)、2μL ddH2O混匀,70 ℃保温10 min,冰浴 1～2 min;依次加入 4μL 5×First strand buffer、4μL dNTP mixture(2.5 mmol/L)、2μL DTT(0.1 mol/L),42 ℃保温 2 min,再加入1μL Reverse Transcriptase(RNase H-)(200 U/L)保温70 min;70℃保温15 min、冰上冷却后得到第一股cDNA。

1.3 轻酶解肌球蛋白基因的PCR扩增

分别以冬季和夏季鲢鱼的第一股cDNA为模板,通过3′-RACE法对编码鲢鱼肌球蛋白重链羧基端的部分轻酶解肌球蛋白基因进行扩增,见图1。正向引物为MYH-12F (5′-CTGCACTCTCAGAACACAAGCCT-3’),该引物根据鲤鱼肌球蛋白重链同工型基因的保守序列设计;反向引物为AUAP通用引物(Abridged Universal Amplification Primer)(5′-GGCCACGCGTCGACTA GTAC-3′)。PCR反应体系如下:5μL第一股cDNA、各5 μL 10μmol/L的正向和反向引物、2.5μLEx TaqDNA polymerase(5 U/μL)(Takara,Otsu,Japan)、10μL 10 ×ExTagBuffer、16μL dN TP Mixture,用无菌水将反应液调至100μL。PCR反应条件如下:94℃预变性4 min、94℃变性30 s、59℃退火1 min、72℃延伸1 min、最终72℃终延伸5 min,共进行30个循环。

图1 鲢鱼部分轻酶解肌球蛋白基因的PCR扩增策略图Fig.1 Schematic representation of PCR amplification for partial light meromyosin from silver carp

1.4 序列分析

通过PCR扩增得到的目的片段经DNA纯化试剂盒(天根生物科技公司,北京)纯化后,与p GMT质粒载体(天根生物科技公司,北京)按1∶1在16℃下用 T4DNA连接酶连接过夜,然后转化感受态细胞 Top10;通过蓝白筛选后,采用 PCR法进行插入检验,每个平板挑选8～10个阳性克隆,由上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。采用Chromas Version 1.62和BioEdit Version 7.0.5对测序结果进行分析。

1.5 氨基酸的亲水性分析和分子系统树的构建

通过BioEdit Version 7.0.5软件,根据 Hopp等[12]的方法对所得鲢鱼两种肌球蛋白重链同工型基因的氨基酸序列进行亲水性分析。分子系统树根据 Saitou等[13]提出的邻接法(Neighbor-joining method)构建。作者将鲢鱼两种同工型的部分LMM区域的氨基酸序列与其他鲤科鱼类和温血动物的相应序列相比较,用CLUSTAL W进行多重比对后,通过 MEGA version 3.1[14]软件对获得的结果进行聚类分析,系统树中各结点的置信度由自引导值(Bootstrap value)估计,重复次数为1 000。用于构建分子系统树的序列除表1中涉及的3种鲤科鱼类的各种肌球蛋白重链同工型之外,其它的序列来自于:Cad-鸡的成熟骨骼肌(U87231)[15]、Rperi-围产期大鼠的肌肉 (X04267)[16]、Rα-大鼠α心脏肌 (X15938)[17]、Rβ-大 鼠β心脏肌(X15939)[18]、Argo-扇贝A rgopecten irradians横纹肌(X55714)[19]、Placo-扇贝Placopecten magellanicus横纹肌 (U59294)[20]、Cgiz-鸡的胃组织(X06546)[21]、Cnon-鸡的非肌肉组织(M26510)[22]。

2 结果与讨论

2.1 鲢鱼肌球蛋白重链同工型基因的分离及部分轻酶解肌球蛋白基因的核苷酸序列比较

以基于冬季和夏季鲢鱼的第一股cDNA为模板,均扩增得到了大约750 bp的DNA片段;将这两个片段纯化后插入p GM-T质粒载体,分别随机挑选8～10个阳性克隆用于测序。结果表明,基于冬季鲢鱼的所有克隆均显示了相同的DNA序列,而基于夏季鲢鱼的所有克隆亦显示了相同的DNA序列。但是,这两种克隆之间在DNA序列上显示了明显的差异,它们之间的核苷酸同源性仅79.5%(表1、图2)。前人的研究工作已经证明了哺乳动物肌球蛋白重链同工型基因之间在3′-和5′-区域会显示大的序列差异[23];Imai等[5]和 Tao等[6]分别从鲤鱼和草鱼骨骼肌中分离到的3种肌球蛋白重链同工型基因之间在终止密码子的上游和下游区域显示了较低的核苷酸同源性。作者从鲢鱼骨骼肌中分离到的两种cDNA克隆之间在终止密码子的上游和下游区域亦显示了较大的核苷酸序列差异,据此,可以认为这两种cDNA克隆代表了两个不同的肌球蛋白重链同工型基因,它们分别被命名为低温型(sc-w)和高温型(sc-s)。Yuan等[24]曾在蛋白质水平上报道了与季节温度变化相关的两种鲢鱼肌球蛋白同工型,他们发现两种同工型之间在蛋白质的热稳定性、凝胶形成特性等方面显示了明显的差异。将鲢鱼两种cDNA克隆与草鱼和鲤鱼的相应核苷酸序列进行比对,发现鲢鱼低温型(scw)与草鱼 10℃型(gc10)之间的同源性高达96.1%、鲢鱼高温型(sc-s)与草鱼中间(gcI)和30℃型(gc30)之间的同源性则较高;另一方面,鲢鱼高温型(sc-s)较其低温型(sc-w)与鲤鱼3种同工型之间显示了更高的同源性。

表1 鲢鱼、草鱼和鲤鱼轻酶解肌球蛋白cDNA克隆的核苷酸序列及推断的氨基酸序列的同源性Tab.1 DNA nucleotide and deduced amino acid sequences identities between light meromyosin cDNA clones isolated from silver carp and those of grass carp and common carp

图2 鲢鱼、草鱼和鲤鱼部分轻酶解肌球蛋白基因的核苷酸序列比较Fig.2 The comparison in the nucleotide sequences of partial light meromyosin genes from silver carp and those of grass carp and common carp

2.2 鲢鱼部分轻酶解肌球蛋白的氨基酸组成分析

根据编码鲢鱼两种肌球蛋白重链同工型的部分轻酶解肌球蛋白的cDNA序列推断其氨基酸序列,并进行比对,同时与草鱼和鲤鱼的相应氨基酸酸序列进行比较。结果显示,sc-w与sc-s的氨基酸同源性仅为88.1%,见表1;sc-w与gc10之间显示了97.2%的最高同源性。而sc-s与gcI和gc30之间显示较高的同源性,分别为96.8%和94.9%,与cc30显示94.9%的同源性。根据Tao等[6]的报道,gcI也是从30℃驯化的草鱼骨骼肌中分离到的。另外,sc-w、gc10和ccI的氨基酸序列较其它同工型的氨基酸序列均缩短了一个氨基酸残基,见图3。根据Imai等[5]的报道,ccI不同于gcI,它主要是从10℃驯化的鲤鱼骨骼肌中分离到的。结果似乎表明了来自于相似温度环境的淡水鱼在肌球蛋白重链的结构上更具有相似性。然而,sc-w与鲤鱼的cc10之间反而显示了较之与ccI和cc30之间略低的氨基酸同源性,此结果亦出现在草鱼3种与鲤鱼3种全长LMM同工型的氨基酸比对中[7],可能与cc10的基因歧化有关,此推测被以下的分子系统树进一步证明。

由图3的阴影部分可以发现,sc-w和gc10在His-21、Ser-24、Thr-29、Leu-49、Ser-62、Asn-87、Asp-140、Ala-147、Ser-167、Gly-176、Tyr-177、Lys-180、Leu-181、Glu-192、Glu-217 的氨基酸残基位点上显示了与其它同工型不同的特有变异,并且其中His-21、Ser-24、Leu-49、Ser-62、Asn-87、Asp-140、Ser-167、Gly-176、Tyr-177、Lys-180、Leu-181 显示了高度的保守。根据 Hopp等的方法[12],对两种鲢鱼同工型的部分轻酶解肌球蛋白的氨基酸序列进行亲水性分析,结果见图4。两种同工型的氨基酸基本都显示了亲水性模式。然而,这两种同工型的氨基酸的亲水周期还是有些明显的不同,比如sc-w相对于 sc-s在第 31-43、55-58、68-70、79-87、141-145和189-195的氨基酸区域展示了更高的亲水性。

图3 鲢鱼、草鱼和鲤鱼部分轻酶解肌球蛋白的氨基酸序列比较Fig.3 The comparison in the deduced amino acid sequences of partial light meromyosins from silver carp and those of grass carp and common carp

图4 鲢鱼两种肌球蛋白重链同工型基因部分轻酶解肌球蛋白氨基酸序列的亲水性分析Fig.4 Hydrophilicity analysis of partial deducedamino acid sequences for light meromyosin from the two types of silver carp myosin heavy chain isoform

我们已经在蛋白质水平上通过差示扫描量热仪(DSC)和流变仪对冬季和夏季鲢鱼的肌球蛋白热稳定性和凝胶形成特性进行了测定,发现前者的热稳定性明显低于后者,且两者之间在凝胶形成模式上显示了明显的差异[11];Tao等[25-26]报道了10℃驯化和冬季草鱼的肌球蛋白热稳定性较30℃驯化和夏季草鱼的明显要低,彼此之间亦显示了不同的凝胶形成模式。据此,可以认为不同肌球蛋白重鲢同工型在轻酶解肌球蛋白特定区域氨基酸残基上的变异可能导致它们之间在结构上的差异,进而引起功能性质上的变化。这样,似乎基于低温驯化的淡水鱼表达的肌球蛋白重链同工型必须在它们的初级结构上发生某些氨基酸残基的变异才能有助于其适应低温的栖息环境。

2.3 分子系统树分析

我们根据3种鲤科鱼类和两种温血动物的骨骼肌、心脏肌或非肌肉组织的部分LMM氨基酸序列构建了分子系统树。由图5所示,系统树分为3个主要的分支:一个最大的分支由草鱼、鲢鱼和鲤鱼的骨骼肌、温血动物鸡的成年骨骼肌以及大鼠的心脏肌的肌球蛋白重链同工型组成,其自引导值为99%;另两个分支分别由非脊椎动物的扇贝肌和鸡的非肌肉组织的肌球蛋白重链同工型组成,它们的自引导值均为100%。在大分支中,3种鲤科鱼类的8个肌球蛋白重链同工型形成了一个大组,其中,gcI、gc30、sc-s和cc30均从高温栖息的鱼肌肉中分离,因此,它们之间显示了更近的基因距离;而ccI、sc-w、gc10均从低温栖息的鱼肌肉中分离,它们之间则显示了近的基因距离。虽然cc10也是来自于低温驯化的鲤鱼,但在这个大组中,它形成了独立于其它类型的分支,其自引导值为72%。来自于鸡的非肌肉组织的肌球蛋白重链同工型与所有其它来自于骨骼肌的肌球蛋白重链同工型之间显示了低的同源性。分子系统树的分析结果进一步证明了广温性淡水鱼肌球蛋白重链的基因歧化和功能进化在很大程度上受栖息环境温度的影响。这些结果完全符合了前人报道的对鲤鱼和草鱼所作的相关分析结果[7,27]。

图5 根据鲢鱼和其它生物的轻酶解肌球蛋白氨基酸序列构建的分子系统树Fig.5 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of partial light meromyosins from silver carp and those of other species

3 结 语

作者通过RT-PCR法和3′-RACE法从冬季和夏季鲢鱼的骨骼肌中分别分离到一种低温型(sc-w)和一种高温型(sc-s)肌球蛋白重链同工型基因,两种同工型基因的cDNA序列包含了部分3′-翻译区和全部3′-非翻译区,编码了鲢鱼轻酶解肌球蛋白(LMM)羧基端的一部分氨基酸序列。两种同工型之间的核苷酸或氨基酸序列之间显示了较低的同源性;与草鱼和鲤鱼的各种同工型之间的比对结果,基本上显示了来自低温和高温栖息环境的鱼其各自肌球蛋白重链同工型之间具有更高的同源性,表明了广温性的淡水鱼必须在它们的肌球蛋白重链的初级结构上发生某些氨基酸残基的变异才能有助于其适应低温的栖息环境。分子系统树的分析结果进一步证明了淡水鱼肌球蛋白重链同工型的基因距离与它们所栖息的环境温度有关。

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