农家酸菜中乳酸菌的分离与产酸性能研究

闫 肃, 吕嘉枥

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

农家酸菜一直以来备受人们的喜爱，以其营养丰富、味道鲜美、色泽光亮、制作简单而备受青昧.酸菜发酵过程属于乳酸菌发酵的一种，产生了许多有益物质，降低了发酵液的pH值，并抑制了其他有害菌，使酸菜香味独特.但农家酸菜常在食用泡菜后将发酵液倒掉，造成了可循环利用的有益物质浪费[1].由于酸菜的此种特质，所以研究发酵液中乳酸菌的产酸性能对于酸菜的口感和产酸菌菌种的筛选具有重要的意义.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸菜发酵液采集于陕西户县农村.

MRS培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨l0 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，柠檬酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，吐温80 mL，蒸馏水1 000 mL.

1.2 实验仪器

VS-1300～U型洁净工作台，LZD～4自动立式高压蒸汽灭菌锅，PHS-25酸度计，GNP9160恒温生化培养箱，101-1型电热鼓风干燥箱，BS224S电子天平， UV-2600紫外可见分光光度计，SMART生物显微镜.

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化[2]

因乳酸菌主要集中在发酵酸菜汁中，所以分离前需要进行增值培养.活化酸菜汁中的乳酸菌，以1%接种量将酸菜汁接入到MRS液体培养基中进行培养，并于37 ℃隔水式恒温培养箱内进行厌氧培养24 h.按以上方法传代培养3次.

1.3.2 菌种筛选[3]

将各代活化的样品用无菌生理盐水稀释10-1～10-6倍，分别吸取0.1 mL涂布于培养皿中，上面覆一层含有无水碳酸钙的MRS固体培养基，于37 ℃恒温培养36～48 h.挑取长势优良且溶钙圈大的菌落反复进行分离纯化，直至得到纯菌落为止，并将得到的菌落编号保存备用.

1.3.3 pH值测定

用PHS-25型酸度计直接测定，测定时间与酸度同步.

1.3.4 酸度测定[4]

用移液管准确量取5 mL发酵菌液，用去离子水定容至100 mL，取50 mL摇匀后向发酵菌液中加入2～3滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH进行滴定，至微红色30 s不褪色即可.酸度计算公式：

酸度(以乳酸计)=c(v-V)×0．09×k×100/W

其中，c：消耗NaOH溶液的摩尔浓度；v：标定时所消耗NaOH标准溶液的体积；V：空白试验中所消耗的NaOH标准溶液体积；k:稀释倍数;W：样品质量或毫升数；0.09：换算为乳酸的系数，即1 mmol NaOH相当于乳酸的克数.

1.3.5 生长曲线测定

将活化菌种接种于MRS试管液体培养基中，于37 ℃培养48 h，按1%接种量接种到MRS液体培养基三角瓶中，于37 ℃恒温培养.前24 h每间隔3 h取5 mL发酵液，后24 h每隔5 h测其OD600值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标作图，得到该菌株的生长曲线.

2 结果与分析

2.1 菌种初筛选

菌株的产酸高低与溶钙圈的大小呈正相关，由此挑选出5株产酸能力较强的菌株并编号，分别为Lab.1、Lab.2、Lab.3、Lab.4、Lab.5.

2.2 菌落观察

形态特征：将分离纯化的菌种分别涂到 MRS琼脂培养基上, 于37 ℃培养24 h，观察菌落特征,取典型菌落涂片革兰氏染色,油镜下观察菌体形态，发现菌株呈杆状、半球状突起成对或串联，数量较多，如图1～图5所示.由图中可见，在MRS琼脂培养基上的生长特性基本一致，菌落呈白色，圆形，中央凸起，表面光滑，质地均匀，而且在挑取菌体时都有一定的黏性，表面凹凸不平，菌落呈淡黄色.

根据菌株形态和菌落特征观察，初步确定所得到菌株为杆菌[5].

图1 Lab.1菌体形态 图2 Lab.2菌体形态 图3 Lab.3菌体形态

图4 Lab.4菌体形态 图5 Lab.5菌体形态

2.3 菌株的生长曲线

图6 菌株的生长曲线 图7 发酵过程中pH的变化情况

从图6可知，Lab.1～Lab.4的生长状况明显优于Lab.5.对于菌株在MRS液体培养基中培养时，0～5 h为延迟期，5～20 h为对数生长期，20 h以后生长基本趋于稳定.

2.4 菌株的pH和产酸曲线

图8 产酸实验结果

由图7和图8可以看出：Lab.1、Lab.2和Lab.3的产酸能力相似且产酸速度较快，pH由5.5降为4.0. Lab.2产酸量最高，Lab.5产酸最慢且最低，Lab.4次之.酸菜食用时间与乳酸菌的发酵时间关系密切,若前期食用， 咸而不酸； 若后期食用， 酸而不咸，失去酸菜风味， 酸度达到1.2～1.4时为酸菜的最佳食用期[4].筛选出的Lab.1～Lab.4菌株15 h即可达到最佳食用期，大大缩短了发酵时间，提高了生产效率.

3 结束语

通过对传统发酵酸菜中优势乳酸菌的分离初筛，选出5株溶钙圈大、长势优良的菌株，通过形态学观察初步确定为乳酸杆菌，并对其产酸性能进行了研究.在产酸试验中Lab.1、Lab.2和Lab.3的产酸和长势差别不是很大，Lab.4较弱，Lab.5最低，从而对于民间酸菜的发酵和产酸状况有了初步了解.筛选出的菌株Lab.2由于其产酸量较高，可以对其做进一步的发酵研究.本试验可以作为研究农家泡菜发酵液的应用效果和作用机理的一部分，为今后进一步研究酸菜发酵液的性能奠定了基础，同时明确了农家泡菜发酵液不应是一种废弃物，而是一种具有很高利用价值的微生态调节系统.

参考文献

[1] 李文斌,唐中伟,宋敏丽,等．农家泡菜发酵液中乳酸菌的研究[J].食品工程，2009， 3(9)：38-40．

[2] 诸葛健．工业微生物实验技术手册[M]．北京：中国轻工业出版社，2003.

[3] 吴元锋，邹礼根．泡菜中乳酸菌的分离、鉴定及其发酵性能研究[J]．中国食品学报，2007，7(5)：42-46．

[4] 黄 群， 麻成金， 余 佶,等，龙山大头菜乳酸菌的分离与鉴定[J].湖南农业科学,2009 ， (9)： 11-13.

[5] 东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M]．北京：科学出版社，2001.

[6] 伍时华，黄翠姬，石媛靖，等．酸乳菌种分离纯化方法[J]．食品科学，2004，25(10)：162-166．

[7] 王艳梅，马俪珍．泡菜汁中乳酸菌的分离与初步鉴定[J]．天津农学院学报，2007，14(3)：5-8．