桑黄发酵罐放大培养的初步研究

秦俊哲， 张慧洋

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

桑黄，又名鲍氏层孔菌Phellinusigniarius，是目前发现的生物抗癌领域有效率高的大型真菌[1]，因其特有的药用价值，已成为国内外抗癌药物研究的热点.由于生长环境的特殊性，野生桑黄在自然界中生长较困难，产量少，无法满足市场需求，故只能借助于液体培养来获得大量菌丝球，国内桑黄的液体培养大都处于实验室摇瓶培养阶段，有关发酵罐的放大培养也鲜有报道.本文通过在线检测并对比桑黄摇瓶培养和发酵罐培养各指标不同阶段的变化，旨在进一步研究桑黄菌的发酵罐放大培养，为桑黄的大规模生产提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

(1)菌种.桑黄：陕西科技大学微生物菌种室提供.

(2)培养基.PDA综合培养基[2]；种子培养基：玉米粉4%，麸皮2.4%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB1、VB2各10 mg;发酵培养基：玉米粉2.66%，麸皮2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB1、VB2各20 mg.

(3)仪器设备.HYG-IIa迂转式恒温调速摇瓶柜、BIOF-6010S型发酵罐、756PC紫外可见分光光度计、LS-C50L型立式压力蒸汽灭菌器等.

1.2 方法

(1)菌种的活化.将母种接种到PDA综合培养基上于28 ℃培养10 d.

(2)摇瓶培养.50 mL种子培养基装于250 mL三角瓶中，接入4块活化好的0.5 cm2桑黄菌块，于28 ℃、160 r/min条件下培养5 d，得种子液；将150 mL发酵培养基装于500 mL三角瓶中，接入10%的种子液，于28 ℃、160 r/min条件下培养1 d，每隔24 h，随机取两个摇瓶，检测各项生理指标，得摇瓶培养变化规律.

(3)发酵罐培养.将5 L料液装入10 L发酵罐中，接入10%发酵液，常压下，于28 ℃、搅拌速度200 r/min、通气量1∶1(v/v)条件下培养，通过不断加水，使罐中水位维持在同一水平，每隔24 h取样，检测各项生理指标，得发酵罐培养变化规律.

(4)测定项目及方法.菌丝干重：过滤发酵液得菌丝，冲洗至洗出液澄清无色，65 ℃烘至恒重，称重，3次取平均值.pH值：pH计测；DO：通过安装在发酵罐上的电极在线测量；还原糖含量：DNS法[3]；氨基态氮：甲醛滴定法(GB/T 12143.2-89).

2 结果与分析

2.1 桑黄的摇瓶培养

图1 摇瓶培养中菌丝干重及发酵液中还原糖的变化

(1)摇瓶培养中菌丝体干重及发酵液中还原糖变化.由图1知，桑黄在摇瓶中的生长规律为：0～72 h为适应期;72～168 h为对数生长期；168～216 h为稳定期.基质中还原糖含量变化随桑黄的生长呈“弓”形变化趋势，0～120 h由于桑黄生长较慢，耗糖量也较少，且桑黄分泌的各种酶降解培养基中的淀粉及多糖类物质，使还原糖含量上升[4];120 h时还原糖含量达到最高，之后随菌体量的增加，耗糖量也在增加，故还原糖含量呈下降趋势.

(2)发酵液中氨基态氮含量及pH值变化.如图2所示，菌体在生长过程中具有自身调节功能，将pH值逐渐调节向其自身生理生长适宜的范围移动.在培养初期，氨基酸含量缓慢上升，pH则越来越小；随着菌丝的大量生长繁殖，氨基酸被菌体利用，其含量又不断下降，pH开始缓慢上升；末期，氨基酸的含量又会处于缓慢状态，此时pH值稳定在5.5左右.氨基酸态氮含量变化与蒋丽等[5]对猴头菌深层发酵的研究结果有相似的情形.

图2 发酵液中氨基态氮含量及pH值的变化 图3 发酵罐放大培养过程中菌丝干重及还原糖的变化

2.2 桑黄的发酵罐放大培养

(1)发酵罐放大培养过程中菌丝干重及发酵液中还原糖的变化.由图1和图3可以看出，两条生长曲线类似，但也存在一定的差异：首先，摇瓶培养的对数期较发酵罐培养的长，这与两者的环境不同有很大的关系；另外，从菌丝体产量来看，发酵罐培养要比摇瓶培养高得多，主要因为发酵罐采用直接通入空气供氧，加上搅拌器的充分搅拌，使发酵罐中的溶氧更加充足，菌丝体才能够更充分的生长，发酵罐培养产量可达19.86 g/L.放罐时机应该选择在稳定期，此时菌丝量最大，且菌丝体尚未开始自溶，故选择120 h时放罐.随着发酵罐中菌丝体的大量繁殖，发酵液中还原糖含量迅速下降.

(2)发酵罐放大培养过程中氨基态氮含量及pH的变化.由图4知，发酵前期，氨基态氮变化不大，只是略有下降，说明此时培养基中营养物质只有少量被消耗，但在发酵中期,随着还原糖的急剧下降，氨基态氮也呈现下降趋势，只是幅度要比还原糖小，这是菌丝体不断生长消耗营养物质的缘故，120 h后氨基态氮浓度稍有回升，可能是由于菌丝体开始老化自溶，释放出的内容物使氨基氮含量增加[6]；而pH在整个发酵罐培养过程中是呈稳定下降趋势的，最终稳定在5.5左右，表明发酵过程有酸性物质生成，结合发酵罐生长曲线，可以确定发酵最佳pH值为5.5.

图4 发酵罐培养过程中氨基态氮含量及pH的变化 图5 发酵罐培养过程中DO的变化

(3)发酵罐放大培养过程中DO的变化.DO是发酵罐生产中的一个重要参数，由图5知，起初DO缓慢下降，是由于菌丝体处于适应期，生长缓慢，耗氧少，24 h后DO迅速下降，此时菌丝体大量繁殖，发酵90 h时DO达到最小值，120 h以后DO又有所回升，此时的菌丝体开始老化自溶，几乎不再需要氧气.发酵过程中DO最小为45%左右，说明整个过程溶解氧充足[7].

3 结束语

通过在线检测并对比桑黄摇瓶和发酵罐培养的各项动态指标，可以得出以下结论：摇瓶培养在10%接种量、28 ℃、160 r/min的条件下，菌丝量在144 h可达到最大，还原糖含量在120 h最高，氨基态氮在72 h达到最大，最适桑黄生长的pH值为5.5；发酵罐培养在5 L装液量、10%接种量，罐压常压，200 r/min搅拌速度、通气量1:1(v/v)、溶氧充足的条件下，120 h可以达到最大菌丝体量，此时也是放罐的最佳时刻，还原糖和氨基态氮随桑黄的生长而不断减少，最适发酵pH值为5.5，这个同摇瓶培养得出的结论是一样的.

参考文献

[1] 戴玉成．药用担子菌——鲍氏层孔菌(桑黄)的新认识[J]．中草药，2003，34(1)：94-95.

[2] 孔祥君，王泽生．中国蘑菇生产[M]．北京：中国农业出版社，2000：53-60.

[3] 蔡武城．生物物质常用化学分析法[M]．北京科学出版社，1998，8(2)：128-129.

[4] 乐超根，邵 伟．我国食用菌液体发酵进展及其综合利用[J]．湖北二峡学院学报，1997，19(3)：97-101.

[5] 蒋 丽，陈惠音，夏枫耿，等．深层发酵猴头菌的研究[J]．食品科学，2001，22(2)：23-25.

[6] Ajith,A;Janardhanan,K.K.Cytotoxic and antitumor activities of a polypore macrofungus，Phellinusrimosus(Berk) Pilat [J].J Ethnopharmacol，2003，84(2)：157-162.

[7] 顾雅君，王 瑛，刘建荣，等．与食用菌相关主要酶的研究和应用[J].中国食用菌，2006，25(1)：40-42.