仔猪致病性大肠杆菌的分离与鉴定

2010-02-24史丽华

中国兽医杂志 2010年6期

关键词：菌液琼脂菌落

史丽华

(辽宁医学院畜牧兽医学院,辽宁锦州 121001）

辽宁省义县某养猪场饲养种猪200余头,2006年3～4月间,部分10～20日龄仔猪发病,发病率50%～70%。经临床诊断为仔猪大肠杆菌病,我们对发病猪进行了致病性大肠杆菌分离鉴定,对分离菌进行了药敏试验,为防治该病提供依据。

1 材料

1.1 病料来源共3株,分别从患病猪的直肠处取样和病死猪的心血和肝脏中分离。

1.2 培养基及试剂培养基、化学试剂及微量发酵管等,上海生物制品研究所生产。

1.3 试验动物 3周龄小鼠15只,购自辽宁医学院动物房;仔猪由辽宁医学院猪场提供。

1.4 定型血清大肠杆菌O抗原单价血清,购自中国兽医药品监察所。

1.5 药敏纸片药敏纸片由上海市伊华有限公司生产。

2 方法

2.1 细菌分离将病料分别接种麦康凯琼脂平板,37℃培养18～24 h,观察菌落形态。

2.2 纯化培养从麦康凯琼脂平板上挑取单个红色菌落接种于伊红美蓝琼脂平板上,37℃培养18～24 h,然后移植于普通琼脂平板上培养。

2.3 生化试验取待检菌纯培养物分别接种在蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、枸橼酸盐、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、尿素琼脂、三糖铁琼脂(TSI）、

半固体琼脂培养基上,置37℃恒温箱中,培养18～24 h,观察结果。

2.4 致病力测定

2.4.1 菌液制备将分离并鉴定的3株大肠杆菌分别制成悬液(约3 050亿个/m L）。

2.4.2 溶血性试验将病原菌涂于血液琼脂平板上,置37℃恒温箱中培养18～24 h,观察其溶血特性。

2.4.3 动物试验小鼠试验前观察3 d,确认健康后用于试验。随机分为3组,每组5只,两组为试验组,另一组为对照组。试验组腹腔接种菌液,每只0.2 m L;对照组腹腔接种相同剂量的灭菌生理盐水,隔离饲养,观察小鼠发病和致死情况,并对发病死亡小鼠进行细菌分离和鉴定。

2.5 大肠杆菌O抗原血清型鉴定将纯培养物接种普通琼脂平板上,37℃培养18～24 h,用无菌生理盐水制成浓菌液,121℃高压2 h,破坏其K抗原,进行玻片凝集试验确定O血清型。先用微量滴管吸取抗血清于玻片上一小滴,再以等量各菌液加于血清中,即刻将两者充分混匀,如0.5m in内出现明显凝集者为阳性反应,同时以菌悬液与生理盐水混合物作对照,观察有无自凝集现象。

2.6 药物敏感性试验按K-B纸片扩散法将被检细菌涂布接种于普通琼脂平板上,间隔一定距离贴上各种药敏试纸,于37℃培养16～18 h后,观察结果。

3 结果

3.1 细菌分离培养结果在普通琼脂上长出中等大小、圆形、隆起、光滑、湿润、半透明乳白色菌落;麦康凯琼脂平板上长出中等大小红色菌落,伊红美蓝琼脂平板上长出紫黑色、带金属光泽的圆形菌落。

3.2 生化试验结果见表1。

表1 分离菌株的生化特性

分离菌株生化试验结果显示,能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇。对蔗糖、多数不能发酵,少数发酵产酸。尿素酶试验阴性,不产生H2 S,有鞭毛,能运动。符合大肠杆菌的生化特性,证实了分离菌株大肠杆菌的存在。

3.3 致病力测定

3.3.1 溶血性试验被检菌株均具有β溶血。

3.3.2 动物试验接种6～10 h后,试验组小鼠全部发病,大部分小鼠出现拉稀,精神沉郁,低头昏睡,呼吸加快,6只24 h内死亡,4只36 h内死亡。剖检死亡小鼠可见肝脏肿大,有出血点和坏死点;心包淤血;肠道严重臌胀,肠腔内充满水样稀便。采取试验组小鼠的心血、肝和脾接种在普通琼脂平板及普通肉汤,37℃培养20 h,有细菌生长。革兰染色及生化鉴定表明此菌与接种细菌为同种细菌。表明该菌对小鼠具有较强的致病力。对照组饲养7 d后全部存活,剖检未见病变。

3.4 大肠杆菌O抗原血清型鉴定结果三个菌株均为O138。

3.5 药物敏感性试验结果此次分离的大肠杆菌对阿米卡星、环丙沙星、氟苯尼考极度敏感;对庆大霉素、氨苄西林高度敏感;对诺氟沙星中度敏感;而新诺明、红霉素、青霉素和头孢唑啉钠对分离菌完全没有抑制作用。