中药指纹图谱的研究进展

2010-02-13唐兴刚李盛强郭世宁

中国兽医杂志 2010年6期

唐兴刚,李雪,李盛强,郭世宁

(华南农业大学兽医学院,广东广州510642)

中药生产的原材料,因土壤、气候等环境因素及采收加工的不同,实际使用时不能保证药材质量的稳定,经加工提取得到的中间体,每个批次在成分含量、成分组成及各成分比例方面都不能保持一致。因此对中药原材料、中间体及成方制剂的质量控制在中药的应用上占据着很主要的位置。中药指纹图谱借用了法医学上指纹鉴定的概念,对中药的化学信息以现代分析技术给予表征并加以描述,全面反映中药内在化学成分的种类与数量,对判断中药真伪优劣,控制中药原材料、中间体及成品的质量,减少批间差异,并最终控制成品的质量起到了极其重要的作用。

1 色谱指纹图谱

1.1 薄层色谱(T LC)指纹图谱薄层色谱法(TLC)一开始以简单快速的鉴别为起点,20世纪60年代以后很快取代了纸色谱技术,至今在中药鉴别中其应用频率仍然最高,近年来发展的T LC自动扫描仪,用固定波长对薄层的各个斑点作扫描的图谱比目测的层析图谱更为客观准确,也具有更好的指纹鉴别意义。李彩君等[1]以高良姜素为对照品,建立了高良姜药材的薄层色谱定性鉴别,发现高良姜素、山柰素等8个特征荧光斑点构成了高良姜乙酸乙酯提取部位的薄层色谱指纹图谱。刘和平等[2]以柴胡正品北柴胡为基础建立柴胡皂苷高效薄层荧光色谱指纹图谱,并对同属品种南柴胡、锥叶柴胡、多枝柴胡、三岛柴胡、西藏柴胡等的指纹图谱进行比较分析,发现北柴胡指纹图谱由19个特征荧光条斑组成。荧光色谱图像与轮廓扫描图谱结合分析比较,可分为北柴胡指纹图谱模式、锥叶柴胡模式及大叶柴胡模式。北柴胡、南柴胡、多枝柴胡、三岛柴胡虽然总皂苷含量相互有别,但指纹图谱彼此相似。

1.2 毛细管电泳(CE)和高效毛细管电泳(HPCE)指纹图在指纹图谱研究中毛细管电泳(CE)是一种较新的方法,它是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离管道,依据样品中各组分之间电泳速度或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术。毛细管电泳用于检测中药指纹图谱,其优点在于:(1)柱效高。(2)分析速度快,进样体积小(纳升级)。(3)适于直接分析水溶液,可直接分析“脏”样品。(4)大小分子可同时分析,毛细管极易清洗。(5)开发新方法较快,仪器维护简单等。胡坤等[3]以槲皮素为内标,采用毛细管电泳法,对不同批次、不同品种和不同储存时间罗汉果的毛细管电泳指纹图谱进行了比较,建立了罗汉果的毛细管电泳指纹图谱。

HPCE技术在中药材鉴别中的应用是近几年发展起来的,它具有高效、快速、分辨力强、重现性好的特点,在中药质量标准制订方面的优势越来越明显。王钢力等[4]对11种卷柏属药用植物进行了HPCE指纹图谱研究,建立了18个样品的毛细管电泳的指纹图谱。结果显示,各主要色谱峰均显示黄酮特征,说明卷柏属植物在黄酮类成分上既有共性,也存在差别,这种差别对于药材品种的鉴别有着一定的意义。1.3 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱高效液相色谱法(HPLC)作为最常用的指纹图谱研究方法,具有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等特点。中药样品中含有的成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测,方法成熟,是目前指纹图谱研究应用最多的一项技术。付绍平等[5]利用反相高效液相色谱法分析了10个不同产地的北五味子样品,建立了由26个指纹峰和19个共有峰组成的北五味子指纹图谱,确定了5个主要的指纹峰,为科学评价及有效控制北五味子质量提供了新方法。所建立的指纹图谱可以用来区别不同产地北五味子药材的优劣,为进一步控制北五味子的质量提供依据。黄月纯等[6]以广东新会产广陈皮(茶枝柑)指纹图谱为基础建立共有模式,可鉴定市场陈皮是否为广陈皮,为广陈皮质量控制与鉴定提供了参考。费陈忠等[7]采用高效液相色谱法(HPLC)以内标物香兰素、总峰面积以及峰面积最大的9个共有峰为评价指标,建立了新型抗球虫中药复方TF-103的指纹图谱,并采用“中药色谱图分析和数据管理系统”软件进行了相似度计算。结果表明,该法操作简单,精密度和稳定性良好,有助于该中药复方的质量控制和谱效关系的研究。

1.4 气相色谱指纹图谱(GC)气相色谱法(GC)主要用于分析气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸汽压的固体,或者沸点在500℃以下,相对分子质量400以下的物质。在中药质量控制中主要用于挥发油、极性较小的成分或衍生化后的可挥发性成分(如脂肪酸的酯)。GC的特点是灵敏度高、分离度好、分析速度快,定量分析的精密度优于1%。梁倩等[8]采用水蒸气蒸馏法提取了7个产地的丹参花挥发油,对挥发油的主要成分进行了GC分析。GC法分析对比7个产地丹参花挥发油的相似性,结果7批丹参花的挥发油相似度较高,可作为控制丹参花成分的方法之一。

1.5 高速逆流色谱技术(HSCCC)高速逆流色谱技术(HSCCC)是当前国际上较新型的液-液分配技术。该技术应用动态液-液分配原理,利用相对移动的互不混溶的两相溶剂,在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。它不使用固相载体作固定相,克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰型拖尾等缺点。近年来,国内已报道将高速逆流色谱技术应用于天然产物的分离、分析及建立指纹图谱。如将高速逆流色谱和质谱(HSCCC-Ms)联用,分析鉴定生物碱、木脂素及三菇类化合物等,均取得了满意的结果。顾铭等人[9]利用HSCCC分离纯化雪莲、丹参并成功制订了其中药指纹图谱,也很好的说明了HSCCC在指纹图谱方面的应用。

1.6 色谱联用技术

1.6.1 高效液相/质谱联用(HPLC/MS)指纹图谱液质联用技术对被测化合物的确认有很高的可信度,具有灵敏度高、选择性好、精密度高等优点,而且HPLC/MS有易于操作和自动化的特点。目前此项技术已经成为制药业、药物分析与研制领域十分重要的分析方法。张尊建等[10]采用HPLC-UV-MS法对丹参药材、丹参注射液中间体及丹参注射液进行指纹图谱的研究,得到分离度较好的丹参药材、中间体及注射液的 HPLC-UV及HPLC-MS指纹图谱,为丹参药材、中间体及注射液的质量控制提供全面、可靠的依据。刘训红等[11]用HPLC-MS联用技术对不同产地太子参进行分析,测定其总离子流指纹图谱,确定共有峰,并对部分色谱峰进行了初步归属。发现少数产地太子参HPLC-MS指纹图谱差异显著,可作为太子参内在质量评价的依据。

1.6.2 气相色谱/质谱联用(GC/MS)指纹图谱气相色谱作为进样系统,将待测样品进行分离后直接导入质谱进行检测,既满足了质谱分析对样品单一性的要求,还省去了样品制备、转移的繁琐过程,不仅避免了样品受污染,对于质谱进样量还能有效控制。质谱作为检测器,检测的是离子质量,获得化合物的质朴图,解决了气相色谱定性的局限性。王儒静等[12]对灵芝建立GC-MS指纹图谱,并对灵芝硅烷化衍生物进行质谱定性分析,运用模式识别对不同产地的不同品质的灵芝进行鉴别分类,为进一步开发、利用灵芝资源、探索灵芝品质鉴别提供了线索。

2 光谱指纹图谱

2.1 红外光谱(IR)指纹图谱近年来,用红外指纹图谱法鉴别中药的研究较多,在中药标准的构建中也发挥着相当重要的作用,尤其是这一技术作为中药鉴别的辅助手段,发展较快。红外光谱的优点是"多快好省"、是一种绿色分析技术;缺点是这种方法不是"原始方法",很难作为标准方法,且需要大量代表性样品进行化学分析建模。田进国等[13]测试了大量中药的红外光谱,初步建立起对植物药、矿物药进行鉴别的红外光谱分析法。徐永群等[14]首次运用红外指纹图谱对18个产地的中药材赤芍进行了药用部分全组份的快速分析,为赤芍道地商品的鉴别及质量控制提供了可靠的依据。

2.2 紫外光谱(UV)指纹图谱紫外光谱能够给出药效物质基础的结构信息,但所给出的信息是所有化学物质结构信息的加和,不具备指纹特征,但可作为中药指纹图谱研究的辅助方法。邹华彬等[15]采用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法对不同产地、不同采集年份的白芍样品及相近植物赤芍、丹皮样品进行了定量评价。该法可以对至少2个样品进行定量评价,克服了多种中药鉴别方法只能进行真伪鉴别、产地鉴别的局限性,为中药质量的准确定量评价提供了一种新方法。刁云鹏等[16]通过研究得出了紫穗槐果实和叶的紫外光谱指纹图谱能够准确鉴别紫穗槐果实和叶及其混淆品的结论。

3 其他研究方法

3.1 核磁共振氢谱(HNMR)指纹图谱核磁共振氢谱(HNMR)是鉴定有机化合物结构的重要方法之一,可以获得化合物中包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。植物类中药的特征性化学成分的含量是相对固定的,在规范的提取分离条件下,植物类中药的HNMR图谱与植物品种则存在着严格的对应关系,没有混淆的可能性,图谱中的信号强弱反映了混合物中各组分的相对含量,在对特征性提取物进一步分离得到单体后,通过结构鉴定和HNMR研究,可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属。HNMR指纹图谱以其良好的单一性、全面性、定量性、易辨性、明显的特征性和良好的重现性,预示了其在中药鉴定中的应用前景。陈波等[17]用1HNMR分析测定35种从福建、云南、广州、江西等地采集及购买的不同种类的茶叶。检测出包括多种氨基酸在内的20种物质。所得谱图经主要成分分析,实现了不同种类的茶叶以及铁观音产地的区分,并且发现了引起区分的化学成分。3.2 X-射线衍射(XRD)指纹图谱中药材的XRD图谱是药材中所含各种成分的衍射谱的叠加,从整体上反映一般成分和主要成分的分布概况,从而可能提供较全面的有鉴别意义的数据。20世纪80年代末,X线衍射法在我国开始用于中药鉴定。目前,我国要求一类和二类中药新药要附有粉末X线衍射谱。吴云山等[18]应用粉末X线衍射Fourier图谱鉴定法对5个白芍中药材样品进行了分析,获得了白芍的标准X线衍射Fourier图谱及特征标记峰值,显示了X线衍射Fourier图谱鉴定分析方法在中药指纹图谱建立的应用中同样具有广阔的应用前景。

3.3 DNA指纹图谱 DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点,且不受生长发育阶段、供应部位、环境条件的影响,已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景,并保持了强劲的发展势头。罗联忠[19]等收集了23株灵芝栽培菌种为材料,从DNA水平上探讨不同产地的灵芝菌种的差异。最后得到了两条进行扩增分析可以有效鉴别大部分栽培菌种,作为分子标记的随机引物。

4 展望

中药建立标准指纹图谱必须立足于中药的特色,即中药的整体作用特点。这就决定了中药指纹图谱研究的复杂性。目前国际上已普遍认可中药指纹图谱作为中药质量控制的标准。美国FDA、WHO都已规定如果草药的活性成分不明,可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量。在欧共体药品申请注册表格中植物药制品要求对原料、中间体及成品进行标准化控制,即要建立指纹图谱。

目前中药指纹图谱的研究多集中于单味药化学成分的研究,以后对于中药中间体、成品药的研究应该加强。尤其是注射用药物,因其直接进入血液,其质量控制更为重要,应作为主要指纹图谱研究方向。

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