深度探讨COPD患者血清细胞因子与肺功能的相关性*

吴洁

(第三军医大学西南医院老年病科 重庆 400038)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种具有气流受限为特征的疾病,气流受限不完全可逆、呈进行性发展,与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。其发病率高,死亡率高,社会经济负担重,已成为一个重要的公共卫生问题。目前应用细胞因子拮抗剂治疗COPD是一条新的途径,目的是改善或缓解肺功能的减退,但究竟哪种细胞因子对患者的肺功能影响较明显尚无定论。TNF-α,IL-8,GM-CSF是近年来发现与COPD的发生、发展有密切相关的细胞因子,TNF-α增高的患者的体重明显减轻,病人体质下降反复感染,但是与否肺功能减退存在确切的相关性少有报道及IL-8,GM-CSF是否影响肺功能尚无报导,对此我们设计了本实验,旨在观察这些因子与肺功能的相关性,为临床治疗COPD提供有效的治疗手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 JAEGER呼吸驱动仪——德国;AVL-995全自动血气分析仪——瑞士;CUSTO vit m肺功能仪——德国;SPECTRA-Ⅲ分析仪——比利时;Olympus光学显微镜——日本;电热恒温水浴箱——中国上海;钢制纱头鼻夹——德国;洗板器与光密度仪——德国;Olympus纤维支气管镜日本低温离心机——德国;超低温冰箱——日本三洋;干燥箱——上海跃进医疗器械厂。

1.1.2 试剂 TNF-α试剂盒——第四军医大学免疫室;IL-8试剂盒——晶美生物工程有限公司;GM-CSF试剂盒——北京邦定生物医学公司;百令胶囊——中美华东制药有限公司

2.2 研究对象与分组

对照组:从健康查体的人群中随机选取56例,女性26例,男性30例,平均年龄(65±5.6)岁,与患病组无差异,并排除影响肺功能、血清TNF-α,IL-8,GM-CSF的疾病,如过敏性哮喘、急性肺部感染,急性心肌梗死等。

患病组:从2003～2004年重庆某医院呼吸科门诊筛选稳定期COPD患者56例,女性27例,男性29例,平均年龄(64±6.7)岁。COPD的诊断依据2001年4月美国国立心、肺、血液研究所(NHLBI)和世界卫生组织(WHO)共同制定的《慢性阻塞性肺疾病全球倡议》(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease,GOLD)及2002年中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(简称《指南》。结合相应病史,危险因素接触史,体征,应用支气管扩张剂后的肺功能指标等综合分析,按照《指南》提供的临床严重度分级标准将COPD患者分为Ⅰ(n=17例)、Ⅱ(n=20例)、Ⅲ(n=19例)组。分级标准:

Ⅰ级:FEV1/FVC<70%,FEV1≥80%预计值,有或无慢性咳嗽、咯痰症状。

ⅡA级:FEV1/FVC<70%,50%≤FEV1<80%预计值,有或无慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难症状。

ⅡB级:FEV1/FVC<70%,30%≤FEV1<50%预计值,有或无慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难症状。

Ⅲ级:FEV1/FVC<70%,FEV1<30%预计值或FEV1<50%预计值伴呼吸衰竭或右心衰竭的临床征象。注:COPD稳定期:指咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或症状轻微至少在3个月以上。为了研究方便,本试验将ⅡA,ⅡB和成1组,统称为Ⅱ组。选取COPD患者。

治疗组:从每组患病组中随机选取10名患者,分为ⅠT、ⅡT、ⅢT组。

3 体格检查及病史采集

(1)采取问卷形式,面对患者及其共同居住亲属认真详实填写调查表格的基本资料、居住情况、吸烟史、个人及家族史。

(2)体格检查包括血压、身高、体重、心肺状况等指标,填写相关项目。

于晨8～10时清醒状态吸支气管扩张剂(喘乐宁200μg)后应用肺功能仪反复3次测肺功能,取最高值,记录FEV1,FVC,FEV1/FVC等指标,最后确定患者分组。FEV1,FVC的采集以爆发力、快速、用力、深长呼气时所测得的肺活量,并可得到FVC曲线(F-V曲线)与呼气流速峰值(PEF),要求测定过程中呼气时间不少于6秒,且要有≥2秒的平段,每次至少要有3个合格曲线,总次数<8次,环境温度在17℃至40℃之间。可以得到一秒钟用力呼气容积(FEV1)和一秒钟用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1%即FEV1/FVC)。

于晨8～10时抽取静脉血10mL,室温状态下静置1h,放在低温离心机中,以3000转/min离心10min,取血清放入2mL的EP管中,储存在-70℃的冰箱中保存,待测TNF-α,IL-8,GM-CSF。

4 实验室检查

4.1 IL-8测定

采用双抗夹心ELISA法。抗人IL-8单抗包被于酶标板上,人血清中的IL-8会与单抗结合,未结合的将被洗去。加入生物素化的抗人IL-8(二抗),它将与结合在单抗上的IL-8结合而形成免疫复合物。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合,多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。IL-8的浓度与OD(450nm)成正比。

4.2 TNF-α测定

采用抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人TNF-α单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的TNF-α与单抗结合,加入生物化的抗人TNF-α抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶地物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,TNF-α浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-α浓度。

4.3 G-CSF测定

采用抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人G-CSF单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的G-CSF与单抗结合,加入生物化的抗人G-CSF抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶地物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,TNF-α浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中G-CSF浓度。

5 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析与统计学图表的绘制,于各数据进行描述性分析、正态性检验与方差齐性分析。在描述性分析中,对于正态分布的数据,用均数±标准差表示,正态分布的2组数据经方差齐性检验后,

对方差齐者应用t检验,对方差不等的数据采用t检验。发病组与对照组、发病组之间用单因素方差分析(oneway ANOVA),发病组中在给药前后行配对t检验。

6 结果

56名健康对照组血清中的TNF-α,IL-8,GM-CSF值分别为(14.70±6.95)pg/mL,(26.70±1.40)pg/mL,(46.33±16.20)pg/mL,实验Ⅰ组血清中TNF-α,IL-8,GM-CSF平均值分别为(18.36±7.79)pg/mL,(70.31±2.29)pg/mL,(91.07±17.38)pg/mL。Ⅱ组中TNF-α,IL-8,GM-CSF的值分别为(22.56±8.78)pg/mL,(84.49±5.61)pg/mL,(106.78±11.98)pg/mL。Ⅲ组中三者指标分别为(28.46±9.47)pg/mL,(100.37±4.90)pg/mL,(146±18.85)pg/mL。这3种因子在3组之间存着差异(P<0.05),其中Ⅲ组中TNF-α,IL-8,GM-CSF的血清水平最高。

治疗组:口服百令胶囊30d后(每天3次,每次5粒),ⅠT组中血清中TNF-α,IL-8,GM-CSF水平分别是(11.05±2.90)pg/mL,(41.26±23.27)pg/mL,(35.37±9.98)pg/mL。ⅡT组血清中TNF-α,IL-8,GM-CSF的水平分别是(15.39±4.23)pg/mL,(79.48±5.64) pg/mL,(70.72±18.98)pg/mL。ⅢT组中血清中TNF-α、IL-8、GMCSF水平分别是(20.07±5.20)pg/mL,(93.12±7.71)pg/mL,(62.19±12.83)pg/mL。可以看出,血清中TNF-α,IL-8,GM-CSF水平在治疗后有明显下降(P<0.05)。ⅠT组中血清中TNF-α,IL-8,GM-CSF水平降低幅度分别为45.3%,41.3%,61.1%。ⅡT组36.2%,8.9%,41.8%。ⅢT组29.5%,7.2%,31.6%。ⅠT组中FVC,FEV1和FEV1/FVC分别是(2.96±0.42L),(2.45±0.26)L/S和(0.80±0.14)。ⅡT组FVC,FEV1,FEV1/FVC分别是(2.45±0.29)L,(2.02±0.40)L/S,(0.72±0.11)。ⅢT组FVC,FEV1,FEV1/FVC分别是(1.99±0.33)L,(1.77±0.44)L/S,(0.66±0.12)。可以看出治疗后FEV1,FVC,FEV1/FVC明显的改善(P<0.05),其中FVC,FEV1在ⅠT组中改善为28.3%,32%。FVC,FEV1在ⅡT组为23.3%,23.1%。ⅢT组15.7%,22.1%。

患病组TNF-α,IL-8,GM-CSF与FEV1,FVC存在着明显的负相关,其中TNF-α与FEV1,FVC负相关系数分别是r=-0.476,-0.465。IL-8与FEV1,FVC负相关性分别是r=-0.358,-0.365。GMCSF与FEV1,FVC负相关性分别是r=-0.302,-0.226。随着血清中TNF-α,IL-8,GM-CSF水平的增高,FVC,FEV1明显下降(P<0.01)。治疗前后在光镜下观察肺组织慢性纤维增生无明显改善。