脂质相关膜蛋白体外诱导绒毛膜hBD-2基因表达的研究

刘晓健 赵玉定 赵松兰

(江苏大学附属人民医院妇产科 江苏 镇江 202002)

解脲支原体(UU)是女性生殖器感染的重要致病因子,可导致胎膜早破、早产、胎儿宫内感染、产褥期感染等。本研究探讨UU的致病因素脂质相关膜蛋白(LAMPs)刺激绒毛膜产生的hBD-2表达的关系。

1 材料与方法

1.1 冻干Uu3标准株

由中心实验室提供。

1.2 解脲支原体菌液接种于固体培养基培养至对数期,传代2～3次后提取其LAMPs。

1.3 LAMPs提取

按照有关参考文献的方法进行,对数期的UU培养液离心后,沉渣置入37℃水浴箱中孵育使其发生相分离,第二次相分离结束,收集沉淀LAMPs,BCA测定蛋白浓度后备用。

1.4 实验标本

取自10例健康的因社会因素晚孕引产妇女绒毛膜组织,将其剪碎成糊状在冰生理盐水中反复吹洗后称取组织(湿重)300mg,均匀接种于培养瓶。

1.5 培养液为高糖型条件下培养24h,除去未贴壁细胞并换入新鲜培养液。每日更换培养液,原代的细胞80%汇合后,PBS洗1次,胰蛋白酶消化后,吹打成单细胞,以1.0×105/mL接种于新的培养皿传代培养。

1.6 LAMPS刺激试验

绒毛膜细胞于细胞培养板6孔板中密度为5×105/mL,每孔细胞加入不同浓度(0,0.1,1,2,3ug/L)的LAMPS加以刺激,提取细胞总RNA及细胞胞浆蛋白,每个实验均重复。

1.7 RT-PCR检测hBD-2 mRMA表达

上皮细胞总RNA的提取采用上海飞捷生物公司的总RNA极速抽提试剂盒,按其说明进行。 引物设计根据Genbank hBD-2cDNA序列,设计特经检查扩增片段均跨跃内含子hBD-2跨内含子引物:上游5-CCA GCC ATC AGC CAT GAG GGT-3, 下游5-GGA G CC CTT TCT GAA TCC GCA-3, 产物长255bp,符合内参照,扩增片长度为RT-PCR要求,同时用PCR试剂盒里看家基因GAPDH引物为544bp。RT-PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳,紫外线下观察结果,并摄相。取诱导因素刺激过的细胞提取总蛋白,测定蛋白质浓度,电泳hBD-2蛋白,电转印后Western blotting检测,出现条带后观察、照相。

1.8 统计分析

2 实验结果

LAMPs能明显诱导绒毛膜产生hBD-2,HBD-2mRNA表达与LAMPs浓度呈明显的剂量依赖性。相同浓度的 LAMPS刺激绒毛膜12h,24h后绒毛膜的HBD-2mRNA表达呈现出时间依赖性。用SPSS 12.0统计软件分析表中数据,LAMPs与细胞内sBD-2基因相对表达量的关系,P<0.05显著差异,添加不同浓度LAMPs,sBD-2基因的相对表达量均有显著差异,其中添加LAMPs3μg/mL与LAMPs0.1μg/mL之间差异极显著,而且2个不同培养时间之间略有差异。结果表明在较低的浓度下,LAMPs浓度与sBD-2基因相对表达量变化基本呈正相关。

表1 添加不同浓度LAMPs对绒毛膜sBD-2基因在不同时间表达的影响

3 讨论

UU缺乏细胞壁,细胞膜是UU与外界环境发生相互作用的唯一结构,细胞膜由脂质双层和膜蛋白组成,一类为膜本体蛋白,另一类外周膜蛋白。膜本体蛋白和外周膜蛋白统称为脂质相关膜蛋白(LAMPS),是暴露在表面与周围环境各种成分不断相互作用因是影响机体免疫系统的一种主要蛋白。该膜蛋是介导支原体黏附宿主细胞表面,进入侵宿主细胞导致细胞受损与死亡的物质基础。因此对支原体LAMPS的研究是了解UU入侵宿主后与宿主免疫系统相互作用的关键。孕期UU感染与胎膜早破密切相关[1],而支原体感染者发生胎膜早破是正常分娩者的8倍[2]。宫内感染UU造成绒毛受损,最终导致妊娠终止,其机制可能与Uu产生的磷酯酶A、C促使细胞膜中游离的花生四烯酸释放,而花生四烯酸是前列腺素的必需前体物质,能损伤胚胎组织及其附属物而影响妊娠结局[3]。实验证实Uu产生的高分子质量物质能刺激宿主免疫活性细胞产生释放多种细胞因子而造成绒毛膜的局部免疫损伤,这些都可以导致病理妊娠的发生。

防御素2在正常女性阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢、绒毛膜、绒毛及胎盘组织中广泛表达[4],提示防御素2的基因表达调控、生物学活性对于维系正常妇女及孕妇生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用。宫颈粘液具有强大而广谱的抗菌活性,防御素在子宫颈组织中固有表达,是子宫颈抗感染作用的重要介质[5]。

β-防御素毫摩尔浓度时具有杀伤细菌的能力,纳摩尔浓度时就具有趋化活性,具有间接的免疫启动作用,在较低的分子浓度下,β-防御素能够与这些细胞表面特异性的趋化因子受CCR6相结合,趋化这些细胞朝着受致病微生物侵袭的皮肤或粘膜病灶部位迁移,从而提高机体抵抗微生物感染的获得性免疫反应水平。

本实验发现β-防御素-2在正常产妇绒毛膜组织中表达量较低,LAMPs能明显诱导绒毛膜产生hBD-2,HBD-2mRNA表达与LAMPs浓度与刺激时间呈明显的依赖性。Ganz等在纯化的防御素对人及小鼠肿瘤的作用中发现,其活性由微丝、钙调节蛋白和溶酶体调节,裂解作用呈剂量和时间依赖性。目前在对β-防御素表达分泌量的影响、作用机理研究还不很清楚,有待进一步研究。

[1]林娟,翁云钦,郑巧玲,等.504例妊娠妇女性传播感染疾病相关行为分析[J].中国妇幼保健杂志.2005,20(3):3587.

[2]乐杰.妇产科学[M].第5版,北京：人民卫生出版社,2000:164.

[3]王敬云,刘杰.支原体感染与妊娠[J].中国实用妇科与产科杂志,2001,17(12):713～715.

[4]冯艳,潘小玲,黄宁,等.女性生殖道人Beta-防御素基因的表达[J].中国病理生理杂志,2003,19(11):1564.

[5]陈新年,黄宁,吴琦,等.β-防御素-2基因在子宫颈的固有表达[J].中国病理生理志,1999,8(6):741.