血竭酊的质量控制

程洪兵， 韩石蕊， 赵永旗， 邵海荣(濮阳市人民医院，河南 濮阳457000)

血竭酊是本院应用多年的医院制剂(制剂文号:豫药制字Z04090080)，由血竭、丹参、赤芍、川芎、红花等组成，临床实践证实，本制剂具有活血化瘀、消肿止痛之功效，主要用于跌打损伤、软组织损伤等症的治疗。本研究制定了该制剂中丹参、赤芍、川芎、红花的薄层色谱定性鉴别及君药血竭中血竭素的含量测定方法，现报道如下。

1 材料

美国Waters 515高效液相色谱仪;瑞士Precisa电子天平(型号:92SM-202A)。血竭素高氯酸盐对照品(中国药品生物制品检定所，批号为:110811-200704);丹参对照药材、赤芍苷对照品、川芎对照药材、红花对照药材(中国药品生物制品检定所，批号分别为120923-200509;110736-200628;120918-200608;120907-200609);薄层色谱用硅胶G及硅胶GF254(青岛海洋化工有限公司);血竭酊(批号分别为080923，081215，090312，090528)及阴性样品均由濮阳市人民医院制剂室提供;乙腈、甲醇为色谱纯;磷酸二氢钠、磷酸、盐酸、醋酸钠、三氯甲烷、乙醚等均为分析纯;水为注射用水。

2 方法

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 丹参 取本品30 mL，置水浴上浓缩至约15 mL，加乙醚振摇提取3次(15、10、10 mL)，合并乙醚提取液，回收乙醚至约10 mL;先用1%盐酸10 mL洗涤，再用1%氢氧化钠溶液10 mL洗涤，将洗涤后的乙醚液，浓缩至约1 mL，作为供试品溶液。按样品的制备工艺制备缺丹参的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取丹参对照药材粉末1 g，加乙醚10 mL，置具塞试管中，振摇，放置1 h，滤过，自“先用1%盐酸10 mL洗涤”起，同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-甲醇(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液则无此斑点。

2.1.2 赤芍 取2.1.1项下乙醚萃取后的水层溶液，置水浴上浓缩至约10 mL，用1%盐酸调pH至2～3，再用水饱和的正丁醇提取3次(15、10、10 mL)，合并正丁醇提取液，置水浴上挥干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。按样品的制备工艺制备缺赤芍的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取赤芍苷对照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，阴性对照溶液则无此斑点。

2.1.3 川芎 取本品20 mL，水浴浓缩至约10 mL，再加入三氯甲烷振摇提取3次(15，10，10 mL)，合并三氯甲烷液，浓缩至约2 mL，作为供试品溶液。按样品的制备工艺制备缺川芎的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取川芎对照药材1 g，加60%乙醇30 mL，超声提取30 min，过滤，滤液同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以苯-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液则无此斑点。

2.1.4 红花［1］391取本品40 mL，水浴浓缩至约20 mL，加水饱和的正丁醇振摇提取3次(20、10、10 mL)，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，离心，取上清液，作为供试品溶液。按样品的制备工艺制备缺红花的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取红花对照药材1 g，加60%乙醇50 mL，煎煮1 h，用脱脂棉乘热滤过，滤液同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(3∶2)为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，在氨蒸气中熏15 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显一个相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液则无此斑点。

2.2 血竭素的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液(49∶51);流速:0.8 mL/min;检测波长:440 nm;柱温:40℃;理论塔板数按血竭素计算应不低于3 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取血竭素高氯酸盐对照品9.66 mg，加3%磷酸甲醇溶液制成每1 mL含血竭素高氯酸盐38.64 μg的溶液(相当于28.06 μg的血竭素)(每1 mg血竭素高氯酸盐相当于0.726 mg的血竭素)作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含血竭素高氯酸盐19.32 μg的溶液(相当于14.03 μg的血竭素)，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取样品20 mL，水浴蒸发至约10 mL，转移至分液漏斗中，并用三氯甲烷10 mL分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加入三氯甲烷振摇提取4 次(15、15、10、10 mL)，合并三氯甲烷液至锥形瓶中，水浴(温度不超过70℃)挥干;精密量取3%盐酸溶液25 mL，置上述锥形瓶中，超声提取45 min，滤过;精密量取续滤液20 mL置分液漏斗中，再加10%醋酸钠溶液20 mL，振摇，加入乙醚提取4 次(30、20、10、10 mL)，合并乙醚液，水浴(温度不超过70℃)挥干;加适量甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取处方中不含血竭的其它药材同比例制备阴性样品，按2.2.3项下的方法操作，制成阴性对照溶液。供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液色谱图见图1。

2.2.5 线性关系的考察 分别精密量取对照品贮备液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别吸取10 μL，按2.2.1项下色谱条件进样，测定血竭素峰面积。以血竭素进样浓度(C:μg/mL)对血竭素峰面积(A)进行线性回归，得回归方程为A=14.161C－4.519，r=0.999 8(n=6)。结果表明，血竭素进样浓度在8.42～22.45 μg/mL范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度和稳定性试验 精密量取2.2.2项下的对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件重复进样5次，每次10 μL，以峰面积计算，RSD为1.28%(n=5)，表明仪器精密度良好。室温放置，于 0、1、2、4、8、12 h 分别进样 10 μL，记录峰面积基本不变，RSD为1.63%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

图1 高效液相色谱图

2.2.7 重复性实验 分别精密量取同一批号的样品(批号080923)5份，依照2.2.3项下方法制备供试品溶液并进样，测得峰面积，计算血竭酊的平均含量为13.74 μg/mL，RSD为1.39%，表明本方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密量取已测得血竭素含量(13.74 μg/mL)的同一批号样品(批号080923)6份，分别精密加入血竭素对照品溶液，依照2.2.3项下方法操作，制备溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，并计算回收率，结果见表1。

表1 血竭素的加样回收率试验结果(n=6)

2.2.9 样品含量测定 分别精密量取3批血竭酊(批号为081215，090312，090528)，依照2.2.3项下的方法制备3份供试品溶液，分别吸取对照品溶液和3份供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，测定峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。

表2 血竭酊中血竭素含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 血竭的主要成分为血竭素、血竭红素、(2s)-5-甲氧基-6-甲基黄烷-7醇等［2］。血竭为血竭酊的君药，具有活血祛瘀、消肿止痛、收敛止血生肌之功效，选血竭中含量较高的血竭素作为本制剂的含量控制项，能反映本制剂的质量。用血竭入药的散剂、丸剂、贴剂等剂型，有采用高效液相色谱法测定血竭素含量的报道［3］［1］308，629-630，尚未见高效液相色谱法测定酊剂中血竭素含量的报道。

3.2 在含量测定项的供试品溶液制备过程中，样品曾采用三氯甲烷提取、蒸干、甲醇溶解等步骤处理，液相图谱显示成分太多，血竭素峰形相对较小且分离度不好。依据文献［4］，样品经三氯甲烷提取挥干、盐酸溶液超声溶解、加入20%醋酸钠后乙醚萃取挥干、甲醇溶解等步骤，干扰成分明显减少，血竭素峰分离度好。又进一步对盐酸溶液浓度(1%、3%、5%)进行了考察，结果显示3%盐酸溶液提取最完全。超声时间考察了30 min、45 min、60 min，三者峰面积45 min大于30 min，60 min和45 min无明显差别，确定超声时间为45 min。对血竭酊的取样量、提取溶剂的种类及提取次数等均作了研究，结果为文中所述条件最优。

3.3 配制血竭素高氯酸盐对照品溶液，作紫外光谱扫描，在440 nm处有最大吸收，故选作440 nm为检测波长。曾比较流动相比例40∶60、45∶55、49∶51，在流动相比例为49 ∶51时保留时间最合适。柱温40℃和室温条件下比较，前者峰形对称性好，无拖尾，结果令人满意。

［1］中国药典［S］.2005.

［2］马秋菊，闵 菊.血竭的鉴别［J］.中成药，2007，29(1):附11-12.

［3］李宏志.HPLC法测定骨突贴中血竭素的含量［J］.中国药事，2008，22(4):340-341.

［4］郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用［M］.北京:学苑出版社，1998:1922-1926.