不同采收期山里红叶总黄酮及牡荆素-2″-O-鼠李糖苷含量研究

李云兴， 柴纪严， 吴成举， 英锡相*

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600;2.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁沈阳110032)

山里红叶(leaves of Crataegus pinnatifida Bge.var Major)被中国药典(2005)版所收载［1］，用于活血化瘀，理气通脉［2］。早在东晋《肘后方》中就有山里红叶(山楂叶)“茎叶煮汁，洗漆疮”的记载。一般文献报道并未将其药理作用区分。近年来，有大量的文献报道:山里红叶即山楂叶具有降压、增加冠脉血流量、降血脂、强心等作用。但是，研究证明，不同采收期的山楂叶中总黄酮含量及单体有效成分的含量差异较大。由于山里红叶在此方面研究少有报道，因此我们分别以山里红叶总黄酮及主成分—牡荆素－2″－O－鼠李糖苷［3］为考察指标，采用紫外分光光度法与高效液相色谱法(HPLC)对其含量进行测定，最终通过研究结果分析，确定山里红叶最佳采收期，科学合理的采收山楂叶。

1 总黄酮含量测定

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 3010紫外分光光度计(日本日立公司);AGBP210S电子天平(德国Satorius公司);AS3120A超声提取器。

1.1.2 试药与药品 芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号080－9002);乙醇，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠，以上试剂为分析试剂;不同采收期山里红叶采收于辽阳(5月至10月，每周1次，共23次)。

1.2 方法与结果

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇适量，超声处理使之溶解，冷却，加乙醇至刻度，摇匀，即得。(每1 mL中含无水芦丁0.2 mg)。以芦丁对照品溶液在紫外范围内扫描吸收波长，测得最大吸收波长为509 nm，因此选择此波长为总黄酮测定波长。

1.2.2 标准曲线的制备 精密称取对照品溶液1，1.5，2，2.5，3 mL，分别置10 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠试液4 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，立即照紫外分光光度法在509 nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为:A=11.406C+0.014 8，r=0.999 5。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取山里红叶0.1 g置于具塞锥形瓶中，加不同浓度乙醇适量，超声滤过，精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠试液4 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，即得。

1.2.4 超声提取条件 正交法确定超声提取工艺条件:采用超声波提取主要是利用超声波破碎作用(空化作用)和强化传质(机械作用)，因此，影响超声波提取的因素很多，如:溶剂的浓度、提取时间、溶剂量等，为了更好地比较各因素对山里红叶提取的影响程度，并根据参考文献的影响因素，选取了浓度、时间、溶剂量这3个因素，运用正交法确定超声提取山里红叶的优化条件。见表1。

表1 正交实验因素及水平设计

1.2.5 超声提取工艺考察 结果按表1选择的研究因素及其水平进行实验，实验结果及数据处理见表2。由极差分析可知，各因素对提取率的影响的大小排序为:C(溶量)＞A(浓度)＞B(时间)，优化条件最佳组合为A2B3C1，即50%乙醇10 mL，超声45 min。正交实验结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交实验结果

表3 方差分析

1.2.6 不同采收期山里红叶总黄酮含量测定 在超声萃取的优化实验条件下，分别提取了多个不同采收期山里红叶样品，在最大吸收波长509 nm处测定吸收值，分别计算山里红叶中总黄酮含量。以含量(%)为纵坐标，以采收期(以周记)为横坐标作图，见图1。

2 单体有效成分含量的研究

图1 不同采收期山里红叶总黄酮含量

2.1 仪器与试药

2.1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪四元泵 (美国安捷伦公司);AGBP210S电子天平(德国Satorius公司);AS3120A超声提取器。

2.1.2 试药与药品 色谱纯乙腈、四氢呋喃、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)，其它试剂均为分析纯;对照品牡荆素－2″－O－鼠李糖苷［5］(自制，采用高效液相峰面积归一化法，纯度＞98%)。不同采收期山里红叶(5月至10月，每周1次，共23周)。

2.2 方法与结果

2.2.1 色谱条件 色谱柱:(Diamonsil C18，150 mm×4.6 mm，5 μm)(迪马公司，中国北京);流动相:采用二元梯度系统，溶剂A:乙腈－四氢呋喃(97∶3);溶剂B:1%磷酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表4;检测波长:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:室温;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表4。

表4 梯度洗脱程序

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取不同采收期山里红叶0.1 g置于具塞锥形瓶中，加50%甲醇25 mL，超声45 min，过滤，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。

2.2.3 对照品溶液的制备 取牡荆素－2″－O－鼠李糖苷对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀。最后配置的对照品浓度为1.33 mg/mL，备用。

2.2.4 超声提取条件考察 精密称取不同采收期山里红叶(第17周采收样品)，选取了时间、溶剂这2个因素，确定超声提取山里红叶的优化条件，结果见表5，6。

表5 超声时间考察

2.2.5 标准曲线制备 精密量取对照品溶液适量分别置6个10 mL 量瓶中，其浓度分别为 4，10，25，50，100，400 μg/mL，以色谱峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为:A=5.890 4C－1.873 5，r=0.999 5。

表6 溶剂考察

2.2.6 精密度试验 取山里红药材(第17周采收)6份，按供试品溶液的制备项下方法进样操作，分别测定5次，结果见表7。

表7 精密度试验结果

结果表明，仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取山里红药材(第17周采收)6份，分别按供试品溶液的制备项下方法测定，结果见表8。

结果表明，本方法的重复性较好。

2.2.8 稳定性试验 将第17周采收药材按供试品溶液的制备项下方法每隔2 h进样1次，分别测定其色谱峰面积，结果见表9。

表8 重复性试验结果

表9 稳定性试验结果

结果表明，色谱峰面积在8 h内基本无变化，表明本实验条件下稳定性良好。

2.2.9 回收率试验 精密吸取已知牡荆素－2″－O－鼠李糖苷含量为11.14 mg/g的山里红药材粉末(过2号筛)6份，各0.05 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入牡荆素－2″－O－鼠李糖苷对照品溶液(1.33 mg/mL)0.4 mL，按供试品溶液制备方法操作，即得加样回收溶液，精密吸取加样回收溶液10 μL，注入液相色谱仪中，结果见表10。

表10 回收率试验结果

结果表明，本方法回收率较高。

2.2.10 不同采收期山里红叶单体有效成分－牡荆素－2″－O－鼠李糖苷含量的测定［4］将制备完成的23份供试品溶液分别进样，进样量 10 μL，记录峰面积，计算牡荆素－2″－O－鼠李糖苷含量，对照品及供试品高效液相色谱图见图2。以含量(%)为纵坐标，以采收期(周)为横坐标作图，见图3。

图2 对照品牡荆素-2″-O-鼠李糖苷(a)及山里红叶(b)高效液相色图

3 讨论

通过本实验对5～10月23周山里红叶的考察研究，我们确定了紫外分光光度法测定山里红叶的总黄酮含量的最佳工艺:50%乙醇10 mL，超声45 min。以及高效液相色谱法测定单体有效成分－牡荆素－2″－O－鼠李糖苷含量的最佳工艺:50%甲醇25 mL，超声45 min。综合考虑实验结果及药材采收量因素，可以看出7～9月采收的山里红叶总黄酮含量及牡荆素－2″－O－鼠李糖苷含量较高，由此推断7～9月为山里红叶的最佳采收期。山里红叶有着资源丰富，价格低廉，药理作用显著等优点，具有广阔的发展前景。由于不同采收期的山里红叶化学成分含量相差较大，因此本文以总黄酮及山里红叶中主要成分－牡荆素－2″－O－鼠李糖苷为考察指标，分别运用紫外可见分光光度法与高效液相色谱法，确定7～9月为山里红叶最佳采收期，为科学合理的采收山里红叶提供了科学依据。

图3 不同采收期山里红叶牡荆素-2″-O-鼠李糖苷含量

［1］中国药典［S］.一部.2005:22.

［2］国家中医药管理局.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1999.

［3］Ying Xixiang，Lu Xiumei，Sun Xiaohong，et al.Determination of vitexin－2″－O－rhamnoside in rat plasma by ultra－performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry and its application to pharmacokinetic study［J］.Talanta，2007，72(4):1500－1506.

［4］崔延萍，崔树玉.山楂叶中牡荆素鼠李糖苷含量测定［J］.中草药，2000，31(12):906－907.