改进溶析结晶提纯葛根素

陈晓光， 韦藤幼， 贾守洁， 童张法

(广西大学化学化工学院，广西南宁530004)

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛。葛根中的葛根素具有调节血压、增加冠脉血流量、改善脑循环、抑制血小板聚集、抗氧化自由基等作用，临床应用于冠心病、心绞痛均取得了明显的疗效［1］。但用于注射液中葛根素纯度要求高，否则易引起发热、过敏性皮疹、过敏性休克等症状［2］。目前用于葛根素纯化的方法有结晶法、溶剂萃取法［3］和柱层析法［4-5］等。传统的冷却结晶［6］及超声波结晶［7］对分离葛根素衍生物效果较差，往往需要在结晶前用酸水解法分解葛根素衍生物，并且产率都在1.5%以下。溶剂萃取法与柱层析法虽然也可得到高含量的葛根素，但需要经过反复萃取或层析，工艺较繁琐，规模生产成本较高。

溶析法结晶法［8］操作温度低，但是它的过饱和度不易控制，得到的晶体颗粒小，纯度低。本实验参照文献［9］的方法，提出了改进溶析结晶法，并用其对葛根异黄酮进行提纯，得到葛根素的纯度达到87.8%，得率为89.3%，在纯度和得率上远远高于传统结晶法和超声波结晶法。

1 实验

1.1 实验材料

葛根异黄酮，采用产自陕西省的野葛根Pueraria lobata(Willd.)Ohwi，按文献［10］方法提取制备，经高效液相色谱检测葛根素含量为45%。葛根素标准品(98%，购于中国药品生物制品检定所，批号1107522200511);甲醇(分析纯，广东汕头市西陇化工厂);冰醋酸(分析纯，广东汕头市西陇化工厂);甲醇，(一级色谱纯，广东汕头市西陇化工厂)。

1.2 实验设备

S212型恒速搅拌器(上海申顺生物科技有限公司)、DDD-320型多功能电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司)、Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷仑公司)、SK3300LH型超声波清洗机(上海科导超声波仪器有限公司)。

1.3 实验步骤

1.3.1 传统醋酸冷却及超声波结晶 称取葛根异黄酮5.00 g，加入10倍冰醋酸，在90℃下溶解(冷却法)或在超声波中振荡40 min(超声波法)，然后转移至室温下冷却1 h，过滤，真空干燥，得到初结晶葛根素，两种方法各实验3次。

1.3.2 改进溶析结晶 称取葛根异黄酮15.00 g，用15 mL甲醇使其刚好完全溶解，得到的溶解液。各取一定量的冰醋酸分别做为溶析液和底物，在一定温度及搅拌速度下，将溶解液与溶析液缓慢滴加到底物中，加入完毕后继续搅拌2 h，过滤，洗涤，真空干燥，得到结晶葛根素。

1.4 分析方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为 ZORBAX.SB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相为甲醇-水(25∶75)，流速为1.0 mL/min，室温，检测波长为250 nm。

1.4.2 标准曲线的绘制 精密称取葛根素对照品5 mg，定容于10 mL的量瓶中。在上述色谱条件下进样，进样量分别为2、4、6、8、10 μL，记录色谱峰面积。在 2 ～10 μL 时，色谱峰面积与进样量呈线性关系。线性回归方程为:Y=2 054.5X －121.02，r=0.999 8，线性范围:1 ～5 μg。

1.4.3 葛根素样品的制备 精密称取提纯后的葛根素约16.4 mg，定容于25 mL的量瓶中。在上述色谱条件下进行分析，进样量为6 μL，记录色谱峰面积。

2 结果与讨论

2.1 结晶条件对葛根素纯度和得率的影响

2.1.1 结晶温度 图1为搅拌速率60 r/min，底物用量为溶解液0.8倍，溶解液与溶析液用量比为1∶1，滴加时间为3 h时，不同结晶温度对葛根素得率与纯度的影响。从图中可以看出，葛根素的纯度与得率随着温度的变化均存在最佳值。这是因为温度升高，溶液黏度减小，有利于晶体的生长，但溶解度下降，结晶困难，50℃为最佳温度。

图1 结晶温度对葛根素得率及纯度的影响

2.1.2 搅拌速率 图2为温度50℃，底物用量为溶解液0.8倍，溶解液与溶析液用量比为1∶1，滴加时间为3 h时，搅拌速率与葛根素得率和纯度的关系。从图中可以看出，开始时葛根素的纯度与得率随着搅拌速率的提高而上升，在60 r/min时达到最大值后降低。这是因为搅拌可以促进传质，有利于维持均匀的过饱和度，可以提高葛根素的纯度和得率。但是搅拌速率过大，影响了晶核的形成与晶体的生长，故纯度与得率均下降。

图2 搅拌速率对葛根素得率及纯度的影响

2.1.3 底物用量 图3为温度50℃，搅拌速率60 r/min，溶解液与溶析液用量比为1∶1，滴加时间为3 h时，不同底物用量对葛根素得率与纯度的影响。从图中可以看出，葛根素的纯度随着底物用量的增加而升高，而得率则随着底物用量的增加而降低。这是因为随着底物用量的增加，结晶母液的黏度降低，有利于晶体的生长，故纯度增大，但随着底物用量增大，结晶母液的溶解度变化不大，由于底物用量的加大，致使部分葛根素溶于底物，导致葛根素的得率降低。为了保证葛根素较高的收率和纯度，所以最佳的底物用量为溶解液0.8倍。

2.1.4 滴加时间 图4为温度50℃，搅拌速率60 r/min，底物用量为溶解液0.8倍，溶解液与溶析液用量比为1∶1时，不同滴加时间的影响。从图中可以看出，葛根素的纯度随滴加时间的延长而降低，得率则随滴加时间的延长存在最佳值为4h。这是因为滴加时间短、速度快时，体系的结晶速度跟不上加料速度，导致过饱和度过大，在体系中出现了二次成核现象，虽然收率高，但葛根素晶体颗粒小、纯度低;滴加时间长、速度慢时，由于过饱和度过太小，结晶速度慢，效果也差。只有控制合适的加料速度，使滴加速度与晶体生长速度同步，在一定的得率下得到的晶体纯度才最高。

图3 底物用量对葛根素得率及纯度的影响

图4 结晶时间对葛根素得率及纯度的影响

2.1.5 溶解液与溶析液比例 图5为温度50℃，搅拌速率60 r/min，底物用量为溶解液0.8倍，滴加时间为3 h时，溶析液与溶解液用量比例对葛根素得率与纯度的影响。从图中可以看出，葛根素的纯度与得率随着溶析液与溶解液用量比的增大而提高，在1∶1时达到最大值后，随着溶析液与溶解液的比例增加而降低。这是因为随着溶析液与溶解液用量比的增大，结晶母液的过饱和度增大，葛根素结晶的成核速率与生长速率也增大，因此葛根素的纯度与得率也随之提高。但是当溶析液与溶解液用量比超过1∶1以后，结晶母液的溶解度趋近于不变，而溶析液相对过多，不仅影响了晶体的生长，而且溶解了部分葛根素，导致了得率和纯度下降。

图5 溶析液与溶解液之比对葛根素得率及纯度的影响

2.2 不同结晶方法的比较

表1给出了传统法、超声波法与改进溶析法结晶在结晶时间、晶体纯度与得率方面的比较。传统法与超声波法相比，在普通加热条件下的分子运动强度相对于超声波条件下的分子运动强度弱，有利于晶体的成长，因而加热条件下所得的葛根素晶体纯度最高。超声波结晶属于刺激结晶，浸膏的醋酸溶液处于超声波条件下，促使葛根素分子骤然加速聚集，导致新相的晶核能够迅速生成，因此超声波结晶要比加热结晶速度快，但是超声波结晶是骤变的过程，影响因素颇多，在加速葛根素结晶的形成过程中，也相应加速了部分杂质在醋酸中的析出，导致了纯度的下降。而改进溶析结晶法是利用了底物维持了结晶过程的过饱和度，使得葛根素在结晶过程中能够始终保持着合适的过饱和度，这样既保证了较高的晶体得率，又保证了较高的晶体纯度，而且结晶时间也不是太长。从表中可知，改进溶析法所得到的葛根素在晶体纯度和得率上都远远高于传统法和超声波法。

表1 不同结晶方法结果比较(n=3)

2.3 不同纯化阶段的液相色谱图对照

图6 结晶前(A)后(B)葛根素的液相谱图的比较

图6中，A为结晶前葛根异黄酮的液相谱图，其中葛根素的含量为45%，3′-甲氧基葛根素含量为7.32%，还有其它杂质;B为经改进溶析法结晶后用一定浓度的醋酸洗涤干燥后葛根素的液相谱图，经检测葛根素含量提高到87.8%，并且3′-甲氧基葛根素、大豆苷元和其他杂质也基本被除去。

3 结论

在葛根素不同结晶方法的比较中，虽然改进溶析结晶法耗时较长，但与传统法、超声波法结晶相比，葛根素晶体的纯度与得率提高了很多。改进溶析结晶法能够有效除去3′-甲氧基葛根素、大豆苷元等葛根素衍生物，提高了葛根素的纯度。

改进溶析结晶法纯化葛根素的最佳工艺为:水浴温度为50℃，搅拌速度为60 r/min，溶析液与溶解液的用量比为1∶1，底物用量为溶解液0.8倍，滴加时间为4 h条件下结晶，葛根素的纯度可达到87.76%，得率为89.3%。

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