生物表面活性剂鼠李糖脂发酵液分离纯化研究

李丽(南京华狮新材料有限公司，江苏 南京 211800)

0 引言

表面活性剂结构中一般含有疏水基团和亲水基团[1]，这样的结构使其在有机溶剂和水中均可溶。目前市场上绝大多数的表面活性剂都是通过化学法合成而来，在其生产和使用的过程中都会产生严重的环境污染问题。与传统的化学合成表面活性剂不同，生物表面活性剂是真菌、细菌和酵母等在特定的生长条件下分泌的代谢产物，是一种由微生物合成的表面活性两亲性物质，属于天然表面活性剂[2-3]。

与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂不仅表面活性更优良，而且还具有物理化学稳定性好、低毒、易降解、环境友好及生物相容性好等优点[4]。某些生物表面活性剂还具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等医学药理作用和免疫功能。其中，鼠李糖脂是目前研究最广泛的生物表面活性剂之一[5]，作为一种阴离子生物表面活性剂，鼠李糖脂在生物医药、环境保护、二次采油等方面具有很高的应用潜力。

1 鼠李糖脂简介

1.1 鼠李糖脂的化学结构及其理化性质

鼠李糖脂于1949年第一次被发现报告，一般是由铜绿假单胞杆菌发酵产生，其种类多达60种。作为生物表面活性剂的成员，和其他的表面活性剂一样，鼠李糖脂的结构也由两部分组成，一部分是极性基团，另一部分是碳氢链组成的非极性基团。这使得鼠李糖脂不仅亲水而且亲油，因此，鼠李糖脂不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚等有机溶剂，而且在碱性水溶液的溶解性也很优良。鼠李糖脂的分子结构中一般含有一到两个的鼠李糖分子与一到两个饱和或不饱和的脂肪酸长链(C8-C24)[6-7]，其中鼠李糖分子呈亲水性，脂肪酸碳链呈疏水性。根据鼠李糖脂分子结构中含有的鼠李糖分子的数目，鼠李糖脂可分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂；根据鼠李糖脂分子结构中所含的脂肪酸碳链数量，鼠李糖脂可以分为单脂鼠李糖和双脂鼠李糖。因此，鼠李糖脂的各种同系物可被总结归纳为4类，即单糖单脂、单糖双脂、双糖单脂、双糖双脂结构。

在微生物发酵生产鼠李糖脂的过程中，菌株的生产、培养时间和碳源等因素会影响单、双鼠李糖脂的比例，而鼠李糖脂的化学结构不同，其理化性质和生物学功能也有所不同。单、双不同结构的鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)值分别约在40 mg/L和5 mg/L左右，亲水性鼠李糖脂的CMC值约200 mg/L，而以不饱和脂肪酸为基本结构的鼠李糖脂CMC值则为120 mg/L。鼠李糖脂在不同pH的水溶液中呈现不同形态，一般情况下随pH值的升高，鼠李糖脂水溶液的粒径尺寸减小。根据文献报道，鼠李糖脂在酸性(pH约4～5)条件下，鼠李糖脂会形成囊泡；在微酸性(pH约6.0～6.6)条件下，鼠李糖脂分子间相互作用，在溶液中以薄片结构或脂质颗粒存在；在中性或者碱性条件下，鼠李糖脂分子间相互交联形成小尺寸的胶束，以胶束形式存在[8]。如溶液pH为7.35时，单鼠李糖脂分子间相互聚集形成分子量为38 kDa的胶束；溶液pH为8.5时，双鼠李糖脂分子之间相互聚集形成分子量为7 kDa的胶束[9]。另外，加入乙醇会破坏鼠李糖脂胶束。龙旭伟等[10]研究发现，在pH为8乙醇加入量为30%的条件下，鼠李糖脂的水力学粒径降至1 nm以下。

1.2 鼠李糖脂的优点及用途

鼠李糖脂不仅具有较好的乳化、破乳、消泡、增溶、湿润等功能，还具有低毒、环境友好、易生物降解、降低表面张力的能力显著等优点，最重要的是，在强酸强碱高盐等极端环境下较稳定。因此，鼠李糖脂在生物医药、石油化工、食品、环境保护及农业等领域被广泛应用。

在石油开采中，添加鼠李糖脂降低水、原油、岩石间的界面张力，可以提高原油采收率。据文献[10]报道，鼠李糖脂浓度为338 mg/L左右可以回收油泥中92%以上的原油；在原油体系中添加鼠李糖脂，20天后原油降解率由35.7%增加至57.6%；鼠李糖脂浓度为500 mg/L左右时，可提高25%～45%的原油采收率。

在医药和食品工业中，鼠李糖脂因具有抑菌、抗病毒、增溶等特性被广泛应用。国外课题组采用三种铜绿假单胞菌，使用不同类型的碳源发酵得到鼠李糖脂混合物。经研究发现，该鼠李糖脂混合物对很多革兰氏阳性菌均有抗菌特性；鼠李糖脂对真菌及植物病原菌也表现出优良的抑制效果。在医药行业中，也发现鼠李糖脂对病毒和线虫等具有抵抗和杀灭的功效。在农业行业中，有学者为了增强保鲜效果，使用鼠李糖脂和蔗糖酯等制成的涂膜保鲜剂，保鲜效果显著。

在日化和环境修护方面，良好的洗涤性能和表面活性使鼠李糖脂可用于织物表面污渍的清洗和土壤中重金属离子和有机物的洗脱。将10%的鼠李糖脂添加至去污剂中，用于织物表面的清洁洗涤，发现对织物表面的食用油污渍去除率达30%以上，对巧克力及蛋白类污渍去除率高达90%左右。鼠李糖脂作为阴离子型表面活性剂可以螯合土壤中的重金属阳离子，尤其对Cd2+的螯合能力最强，可用于重金属离子污染的土壤修复。龙旭伟等[10]使用鼠李糖脂发酵液直接洗涤被蛋白污染的膜，将pH为9鼠李糖脂浓度为300 mg/L的溶液作为膜清洗剂，清洗膜设备1 h后，膜元件的水通量恢复至新膜的95%左右。

1.3 鼠李糖脂的生产

目前主要采用发酵的方法生产鼠李糖脂，发酵工艺包括固态发酵、液态发酵和泡沫发酵等。固态发酵是在有一定湿度的水下溶性固态基质中，由一种或多种微生物参与的一个生物反应过程，该发酵工艺过程中没有或几乎没有自由水存在。该工艺具有投资少、成本低、易操作以及下游处理比较简单等优点，但该工艺发酵周期长、劳动强度大、工艺参数控制困难，不适合大规模在生产中应用。泡沫发酵工艺是在发酵的同时耦合了分离方法，可以部分实现连续发酵。该工艺的优点是在发酵的同时进行了产物的分离纯化，但通过该工艺得到的鼠李糖脂中含往往有大量的菌体，纯度较低，而且泡沫溢出口和补料口的染菌风险较大。液体发酵是指将物料首先制备成液态，再将微生物接入而产生的生物反应过程，具有速度快、成本低和产量高等优点，是鼠李糖脂生产中最常用的发酵工艺。

铜绿假单胞菌是鼠李糖脂的主要产生菌，发酵所用的碳源一般分为疏水性碳源和亲水性碳源，其中疏水性碳源一般为植物油、废油和烃类等，亲水性碳源一般为葡萄糖、甘油、乙醇等。发酵过程中还需要用到氮源，一般选用硝酸铵、尿素以及一些无机氮源等。选择合适的碳源和氮源，通过实验探索出最优的C/N比例，而后通过对发酵时间，发酵过程中的温度、pH、溶氧等条件的探索，找到最优实验工艺参数发酵得到高产量的鼠李糖脂发酵液。

2 鼠李糖脂发酵液的分离纯化

鼠李糖脂在微生物发酵液中的产量较低，约3 g/L。发酵液中主要含有鼠李糖脂、菌体、未消耗完的培养基以及生产菌的其他代谢产物等，成分比较复杂。因此，从发酵液中提取鼠李糖脂的难度较大。根据文献中报道，鼠李糖脂发酵液的分离纯化成本约占鼠李糖脂生产总成本的60%～70%。

鼠李糖脂易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶剂，在中性水溶液中溶解性良好，在酸性条件下容易形成沉淀析出，在碱性条件下形成小尺寸的胶束。因此，鼠李糖脂发酵液的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、酸沉法、萃取法、膜分离法、吸附法及泡沫分离法等。

2.1 酸沉-萃取法

酸沉-萃取法是利用鼠李糖脂在酸性条件下容易沉淀，且易溶于有机溶剂的特性。具体操作如下：首先将发酵液离心后去除菌体，在离心后的上层清液中，加入浓盐酸调节上清液的pH至1.5～2.0，此时，发酵液中出现混浊悬浮状沉淀；而后将其置于0～4 ℃环境中过夜，第二天取沉淀加入有机溶剂进行萃取，观察萃取效果。若效果不好，可进行复萃，最后将所有萃取液收集，使用旋转蒸发仪蒸发后得到鼠李糖脂。萃取剂一般选用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇及氯仿等，或者将两种有机溶剂按照一定比例混合后使用。该方法应用范围广、易操作、可通过调节有机溶剂的比例改变极性、操作灵活。但这种方法择性差、收率低、过程中需要使用大量的盐酸及有机溶剂、废液处理难度大，大大限制了该方法的大规模使用。

2.2 吸附法

吸附法是利用吸附材料的吸附能力，其中吸附材料一般是苯酚甲醛离子交换树脂、聚苯乙烯树脂或者活性炭等。该类型材料同时具有吸附和解吸作用，可以对发酵液中的生物表面活性剂进行选择吸附，使其富集吸附在材料表面，而后再选择合适的洗脱液将其洗脱。具体操作是：首先，将鼠李糖脂发酵液离心后取上层清液；第二步，将上层清液倒入装有吸附剂的吸附柱中，用缓冲溶液调节其pH，而后用去离子水洗涤吸附剂，以便去除可溶性物质及游离脂肪酸；第三步，使用合适的有机溶剂将鼠李糖脂洗脱；最后，旋转蒸发得到鼠李糖脂。该方法可以连续进行，吸附剂可循环使用，所需设备简单，但过程中会使用有机溶剂作为洗脱液，产生较多的废液，同时鼠李糖脂收率较低。

2.3 泡沫分离法

泡沫分离法是利用生物表面活性剂在临界胶束浓度以上形成胶束的特性，是一种连续提取的新方法。具体操作是：在发酵时，采用进气管向发酵液通入空气产生气泡，气泡从发酵液底部移动到顶部破裂。鼠李糖脂作为表面活性物质优先吸附在气泡上，随气泡上升到液体表面形成泡沫。通过收集泡沫即可得到鼠李糖脂。泡沫分离法具有成本低、效益高、空间需求小、操作快速以及能够对产物进行回收的同时进行浓缩等优点，但该方法只适用于发酵液中鼠李糖脂浓度低和能够在分离柱中停留时间长的情况，且产物中有效物纯度低，含有较多的菌体，需要进行二次纯化。

2.4 膜分离法

膜分离法是利用膜孔的筛分作用对物质进行选择性分离的处理技术。在一定压力下，当发酵液流经膜表面时，分子量小于膜孔径的小分子溶质透过膜孔，分子量大于膜孔经的大分子物质被截留，从而实现发酵液中大、小分子的分离，达到流体分离纯化和浓缩的目的。同时，该方法还利用了鼠李糖脂在酸碱条件下粒子的颗粒尺寸不同的特性。具体的操作方法是：首先将发酵液离心后取上清液，在上清液中加入浓盐酸调节其pH值至5左右，鼠李糖脂在酸性条件下会形成脂粒，更易于被膜孔截留；第二步，使用超滤膜在一定压力下过滤上述上清液，鼠李糖脂以大尺寸存在的脂粒结构和大分子的蛋白分子量大于膜孔径被超滤膜截留，而分子量小于膜孔径的小分子无机盐类和色素透过膜；第三步，在上述膜过滤后的浓缩液中加入NaOH调节pH至9左右，鼠李糖脂在该条件下以小尺寸胶束形式存在，更易于透过膜孔，若在该浓缩液中加入一定比例的乙醇等小分子有机溶剂，会破坏鼠李糖脂胶束，使其以小分子形式存在，更易于透过膜孔；第四步，使用超滤膜在一定压力下过滤上一步的浓缩液，鼠李糖脂有效物透过膜孔，大分子杂质被截留，从而达到分离纯化的目的。

3 结语

生物表面活性剂与化学合成的表面活性剂一样具有表面活性，同时具有抗菌、抗病毒、稳定性强、无毒、易降解及环境友好等优点，因此，引发越来越多的关注研究。鼠李糖脂是目前研究最广泛的生物表面活性剂之一，在医药食品、生物化工、环境保护及二次采油等方面具有很高的应用潜力。鼠李糖脂是采用铜绿假单胞菌，通过生物合成路径产生的，发酵时需要选择合适的碳源、氮源及培养基，控制合适的发酵条件。

从发酵液中提取鼠李糖脂的难度较大，分离纯化方法主要包括离心法、酸沉法、萃取法、膜分离法、吸附法、泡沫分离法等。各种方法均有不同的优缺点，一般根据不同的需要和用途，对鼠李糖脂发酵液采用不同的分离纯化方法，可能使用单一的某种方法也可能多种方法结合使用。