降糖1号关黄柏部分的提取工艺研究

张建芬， 陈蔚青， 蒋新龙

(浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015)

降糖1号是临床经验方，由桑白皮、黄芪、女贞子、关黄柏等七味中药组成［1］。具有明显地降低糖尿病患者的血糖水平，改善糖尿病的并发症等功效。为了将其开发成治疗糖尿病的中药新药，更有效的发挥其作用，作者所在的课题组对其进行了提取工艺的研究。根据处方中药物有效成分的理化性质，将处方中的药味分为关黄柏提取部分和黄芪提取部分。关黄柏、女贞子中有效成分多为脂溶性成分，故用乙醇提取;黄芪、地骨皮等五味药材中与降血糖相关的成分多为水溶性成分，故用水提取。关黄柏提取部分以具有降血糖活性的有效成分盐酸小檗碱的得率为指标［2］。采用单因素试验法考察关黄柏、女贞子合提、分提对实验结果的影响，并采用正交试验法优选关黄柏部分的提取工艺。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪:1525二元分析泵、717自动进样器、2996光电二极管阵列检测器、旋转蒸发仪、电子天平。

1.2 试药

关黄柏、女贞子均购自华东医药股份有限公司，关黄柏产地为辽宁;女贞子产地为四川;关黄柏药材为芸香科植物黄檗Pheuodendron amurense Rupr.的干燥树皮。女贞子药材为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。盐酸小檗碱对照品(批号:0713－9906)购自中国药品生物制品检定所;高效液相分析用乙腈为色谱纯，水为双蒸水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱含量测定方法［3－5］

2.1.1 色谱条件

色谱柱为:Waters Nova－Pak R C18柱(150 mm ×3.9 mm，5 μm);柱温:25 ℃;以乙腈－0.1%磷酸溶液(48 ∶52)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)为流动相;流速:1 mL/min;检测波长为265 nm。

2.1.2 盐酸小檗碱线性范围考察

精密称取盐酸小檗碱8.21 mg于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度作为母液;精密吸取母液0.5、0.4、0.2、0.1、0.06、0.02 mL 定容至 1 mL 量瓶，配成 411、328、164.2、82.1、49.26、16.42 μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液。精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程为:y=44 430x－40 253，r=0.999 8，表明盐酸小檗碱在0.164 2～4.11 μg之间有良好的线性。

2.2 关黄柏、女贞子合并提取与单独提取对盐酸小檗碱得率的影响

2.2.1 盐酸小檗碱对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱8.21 mg于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度得盐酸小檗碱的母液，精密取0.5 mL母液于5 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得盐酸小檗碱的对照品溶液(82.1 μg/mL)。

2.2.2 样品供试液的制备

2.2.2.1 关黄柏、女贞子合并提取样品的制备 准确称取关黄柏药材7.5 g，女贞子5.0 g，加10倍量70%的乙醇，回流提取1 h，提取2次，合并提取液，转移至250 mL的量瓶中，加70%的乙醇定容至刻度，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得A供试液，平行制备三个样品供试液。

2.2.2.2 关黄柏单独提取样品的制备 准确称取关黄柏药材7.5 g，照上述样品供试液制备方法制备样品，即得B供试液，平行制备三个样品供试液。

2.2.3 样品供试液含量测定

精密吸取上述样品供试液各10 μL和盐酸小檗碱对照品溶液(245.55 μg/mL)10 μL，注入色谱仪，记录峰面积，计算盐酸小檗碱的含量。结果如表1所示:关黄柏与女贞子合并提取对盐酸小檗碱得率有影响，为关黄柏单独提取得率的72.1%，但影响不是很大，为简化提取工艺，节省生产成本，综合考虑将关黄柏与女贞子合并用乙醇提取。

表1 关黄柏、女贞子合提与关黄柏分提对盐酸小檗碱提取得率的影响

2.3 关黄柏部分提取工艺优选

2.3.1 关黄柏部分提取工艺因素水平的确定

处方中关黄柏和女贞子合并后用乙醇提取，以盐酸小檗碱的提取得率作为评价指标［6］，结合文献与预试验的结果，确定了对盐酸小檗碱提取得率影响较大的四个因素:乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数，并确定了各因素的水平。见表2。

表2 正交试验因素水平表

2.3.2 关黄柏部分药材的提取

按处方比例准确称取关黄柏药材4.5 g，女贞子药材3.0 g，95℃水浴回流提取，按L18(73)正交表安排试验，提取液定容至250 mL量瓶。

2.3.3 盐酸小檗碱对照品溶液的制备

按照2.2.1项方法制备。

2.3.4 关黄柏部分样品供试液的制备

取18次实验的样品溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，即得。

2.3.5 测定方法

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液(82.1 μg/mL)和样品供试液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算样品中盐酸小檗碱的含量，结果如表3所示。

2.3.6 实验结果的分析

方差分析结果表明(表4):提取次数和乙醇用量对盐酸小檗碱得率影响较大，具有极显著性意义，乙醇浓度与提取时间对盐酸小檗碱的得率影响较小，各因素对盐酸小檗碱得率影响的次序为:D＞B＞A＞C。直观分析，A因素选2水平;B因素对盐酸小檗碱得率影响较大，具有极显著性意义，因此B因素选3水平;C因素对盐酸小檗碱得率没有显著性差异，故选择1水平;D因素对盐酸小檗碱得率的贡献最大，具有极显著性意义，因此选3水平。A2B3C1D3为最佳方案。

表3 L18(73)正交实验及结果表

表4 方差分析表

2.3.7 正交实验的验证

根据以上确定的工艺条件验证3批，盐酸小檗碱含量及浸膏得率结果如表5所示。可见，验证试验结果与正交试验结果一致。据此确定关黄柏、女贞子乙醇提取的工艺条件为A2B3C1D3，即10倍量70%的乙醇提取3次，每次1 h。

表5 验证试验结果

3 讨论

3.1 中华人民共和国药典一部收载的关黄柏药材中盐酸小檗碱含量测定的流动相为［1］:乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)，按此方法测定，盐酸小檗碱不能达到基线分离，可能是女贞子中的某些成分影响了盐酸小檗碱的分离;故增大了缓冲盐的比例，最终确定了上述的分析方法。

3.2 关黄柏与女贞子合并提取对盐酸小檗碱得率影响不是很大，为简化提取工艺，节省生产成本，综合考虑将关黄柏与女贞子合并用乙醇提取。以优化的条件A2B3C1D3，即10倍量70%的乙醇提取关黄柏、女贞子3次，每次1小时进行工艺验证，进一步证明此法提取可得到含量稳定的有效物质。

［1］中国药典［S］.一部.2005:99，214.

［2］鲁云博，杨广德.黄柏中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀提取方法研究［J］. 中成药，2004，26(3):186－189.

［3］周德庆，郭志雄，罗泽渊，等.HPLC法测定黄柏中黄柏碱的含量［J］. 中成药，2003，25(12):1002－1004.

［4］唐艳梅，叶 萌，向 丽，等.HPLC测定黄柏中的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱［J］.华西药学杂志，2006，21(3):265－267.

［5］时维静，陈文成，谭志静.HPLC法测定黄柏不同炮制品中小檗碱的含量［J］.中国药事，2009，23(2):134－132.

［6］施 群，施淑琴.川黄柏中盐酸小檗碱的超声提取工艺研究［J］. 江西中医药，2009，40(313):59－60.