酒当归饮片质量标准研究

华永丽， 郭延生， 杨洪申， 杜天玺， 杨小虎， 秦 亮， 曲亚玲， 魏彦明

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070)

当归为伞形科当归属植物当归(Angelica sinensis(Oliv)Diels)的干燥根。当归性温，味甘辛，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的作用［1］。当归主产于甘肃，长期以来，在临床实践中采用不同的炮制方法，使其发挥不同的临床疗效。研究表明当归通过酒炒后，挥发油的颜色变深，折光率增大，有效成分在水中的溶解度增大，活血通络的作用增强［2］，具有活血散瘀的作用［3］。临床常用于血瘀、经闭、痛经、产后瘀滞腹痛、跌打损伤及风湿痹痛，经络不利等症。对酒当归进行全面质量控制，是保证临床用药安全、有效的必要手段，但酒当归中大多数化学成分无法进行准确定量。因此，本研究在酒当归传统鉴别的基础之上，探讨一种针对复杂系统，多组分化学物质的定量方法，以提高酒当归质量控制水平。

1 实验材料

1.1 实验仪器 显微镜、自动薄层制板器、KQ-360DE型数控超声波清洗器、玻璃仪器烘干器、TDI5-WS多管架自动平衡机、电子天平(型号AL104)、美国Agilent 1100型高效液相色谱仪、克罗玛-薄层观察分析仪(254 nm，365 nm)、称量瓶、坩埚、微孔滤膜、移液枪、电热恒温鼓风干燥箱、SX-4-10智能纤维素电阻炉、循环水式多用真空泵(型号SHB—111)。

1.2 实验药品 水合氯醛、稀甘油、乙醚、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、1%碳酸氢钠、甲醇、硅胶G薄层、正己烷、苯、2%碳酸钠等，所用试剂均为分析纯。当归对照药材(批号120927-200613中国药品生物制品检定所)、阿魏酸对照品(批号0773-9910中国药品生物制品检定所)。含量测定所用试剂均为色谱纯。

1.3 酒当归 取不同产地当归饮片，用定量黄酒拌匀，闷透，酒被吸尽后，放炒制容器内，用文火加热，炒干至深黄色，取出晾凉［3-4］。见表1。

表1 甘肃省14个不同产地的酒当归样品Tab.1 Origins of Angelica sinensis(oliv.)Diels and sample code of processed with wine

2 方法与结果

2.1 饮片性状研究

2.1.1 酒当归 当归头切片有大有小。最大的长为2.7 cm，宽为1.6 cm，厚为0.2 cm，最小的长为1.1 cm，宽为0.9 cm，厚为0.2 cm。表面颜色呈黄棕褐色，具有纵皱纹，断面形成层为黄棕色，木质层颜色较浅。还混有粗细长短不一的归耳，归尾其表面层为棕褐色，但较炮制前较深。根头部断面层有空腔和髓。有浓郁的香气和淡淡的酒味，味甘，辛温，见图1。

图1 酒当归饮片Fig.1 Parching Angelica with wine

2.1.2 生当归 当归头的切片有大有小，较大的长为3.3 cm，宽为1.8 cm，厚为0.4 cm，较小的长为1.4 cm，宽为1.1 cm，厚为0.3 cm。表面颜色呈棕褐色，断面形成层颜色为棕黄色，呈环状，木质层颜色较浅，还有粗细长短不一的归耳，归尾。其表面层均呈显棕褐色，根头部断面有空腔。气味浓郁，味，甘，辛，味苦，见图2。

图2 生当归饮片Fig.2 Unprocessed

2.2 饮片鉴别研究

2.2.1 粉末显微鉴别 酒当归:粉末颜色为淡黄棕色;导管颜色较深，其中梯纹网纹导管多见;木栓细胞中间带为棕黄色;可观察到油室及碎片，但比较少;薄壁细胞呈纺锤形，其中间带为黄棕色。见图3。

图3 酒当归粉末显微Fig.3 Powder microphotograph of wine-baked Angelica

2.2.2 薄层色谱鉴别

2.2.2.1 当归对照药材薄层色谱鉴别 取酒当归粉末0.5 g，加乙醚10 mL，超声处理10 min，滤过，取滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取生当归对照品粉末0.5 g，依供试品同法操作，即为对照品溶液;吸取上述15种溶液各5 μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以正己烷—乙酸(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯下365 nm波长处观察荧光斑点。见图4。

图4 酒当归与生当归对照药材比较薄层图Fig.4 TLC of wine-baked Angelica and the comparison with control medicinal material of unprocessed Angelica

2.2.2.2 阿魏酸薄层色谱鉴别 取14个产地酒当归粉末各3 g，加1%碳酸氢钠50 mL，超声处理10 min，离心，取上清液，用稀盐酸调至pH值2～3，用乙醚震荡萃取2次，每次20 mL。合并乙醚液蒸干，残渣加甲醇1 mL，使溶解作为供试品溶液。吸取上述14种溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上;另吸取10 μL阿魏酸点于同一块硅胶G薄层板上作为对照样品。以正苯—乙酸乙酯—甲酸(4∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯下365 nm波长处观察荧光斑点。见图5。

图5 酒当归与阿魏酸对照品比较薄层色谱图Fig.5 TLC of wine-baked Angelica and the comparison with ferulic acid

2.3 检查 按《中国药典》2005年版一部(附录)，分别测定当归样品中的水分，总灰分，酸不溶性灰分，浸出物测定法项下醇溶性浸出物测定法热浸法测定，结果见表2。

表2 14个产地酒当归样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的百分含量Tab.2 The contents of water，total ash，extract in 14 different origins wine-baked Angelica

2.4 基于酒当归的指纹图谱的样品含量测定

2.4.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB2C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)分析柱;流动相:1% 乙酸水(A相)∶乙腈(B相);梯度洗脱条件:B，0～10 min(20%～30%);10～20 min(30%～49%);20～40 min(49%);40～50 min(49% ～100%);50～60 min(100% ～20%)。流速:1 mL/min;柱温:25℃;检测波长:280 nm。

2.4.2 阿魏酸对照品溶液制备 精密称取阿魏酸对照品1.5 mg，加甲醇至25 mL量瓶中，得60 μg/mL溶液，再取2 mL的溶液至25 mL的量瓶中，得4.8 μg/mL的阿魏酸对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液制备 精密称取当归粉末(40目)0.5 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液25 mL加入三角瓶中，密封，称重，超声提取60 min，放置至室温，称重，补足失重，0.45 μm滤膜过滤。取续滤液进样10 μL。

2.4.4 参照峰的选择 由于阿魏酸是当归中的主要有效成分，且2005年版《中国药典》规定其为评价当归质量的指标性成分，选择阿魏酸色谱峰作为参照峰，计算各共有峰的相对含量。

2.4.5 方法学考察

2.4.5.1 精密度 取同一份当归样品(j-4)的供试液，重复进样5次，计算得各主要色谱峰的相对保留时间RSD为0.03% ～0.14%，峰面积比值RSD为0.54% ～2.06%，符合指纹图谱的检测要求。

2.4.5.2 稳定性 取同一份当归样品(j-4)的供试液，分别于0、3、6、9、12 和 15 h 检测，计算各主要色谱峰的相对保留时间RSD为0.03% ～0.12%，峰面积比值RSD为0.29%～2.66%，表明供试液在15 h内基本稳定。

2.4.5.3 重复性 取酒当归饮片样品(j-4)6份，分别精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备供试液，再分别按上述液相色谱条件测定，计算各主要色谱峰的相对保留时间RSD为0.28% ～0.46%，峰面积比值RSD为0.75% ～1.82%，符合指纹图谱的检测要求。

2.4.5.4 线性关系的考察 精密吸取浓度为4.8 μg/mL 的阿魏酸对照品溶液 2、6、10、14、18 μL，注入液相色谱仪，按2.4.1项色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程:Y=82.012X－41.053，r=0.999 8。结果表明阿魏酸在0.096～0.864 μg范围内线性良好。

2.4.5.5 回收率试验 取已知含量样品0.5 g，共5份。置具塞三角瓶中，精密加入阿魏酸对照品适量，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液 25 mL，按2.4.3项下自“加入三角瓶中”起制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液10 μL进样，测定峰而积。外标一点法计算含量。5次测定的回收率平均为(97.9±1.4)%。

2.4.5.6 当归样品中指纹峰的定量 按上述液相色谱条件测定了自14个不同产地的14份酒当归样品3份平行样品，根据各样品图谱中色谱峰的相对保留时间和阿魏酸对照品的相对保留时间，鉴定11个指纹峰，见图6、7。峰1为阿魏酸，将指纹峰的紫外光谱与文献［5-8］比较，推测峰2-11依次为洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、未知、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、丁基酜内酯，E-藁本内酯、Z-藁本内酯、Z-丁烯基酞内酯、levistolide A.。对这些指纹峰含量以基准峰阿魏酸为依据，计算每个指纹峰的相对含量，结果见表3。并计算其不同产地酒当归及生当归样品11个指纹峰面积归一法百分含量及其在总峰面积所占比例，结果见表4。由表4可以看出，其指纹峰峰面积所占比例在58% ～70%之间，能够反映酒当归样品化学成分的基本情况。

图6 14个不同产地酒当归饮片HPLC指纹图Fig.6 HPLC chromatograms of winebaked Angelica in 14 different origins

图7 生当归饮片HPLC指纹图Fig.7 HPLC chromatograms of unprocessed Angelica

表3 14批酒当归样品指纹峰以阿魏酸计相对含量测定结果(±s)(mg/g)Tab.3 The relative peak aear of characteristic peaks in 14 different wine-baked Angelica(±s)(mg/g)

表3 14批酒当归样品指纹峰以阿魏酸计相对含量测定结果(±s)(mg/g)Tab.3 The relative peak aear of characteristic peaks in 14 different wine-baked Angelica(±s)(mg/g)

注:计算方法:以基准峰计指纹峰含量=(指纹峰峰面积/基准峰峰面积)×基准峰含量;1为阿魏酸基准峰。

样品 1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0±0.19 0.19±0.00 0.34±0.01 13.52 j-2 0.40±0.01 0.61±0.02 0.14±0.01 0.09±0.00 1.17±0.04 0.36±0.01 0.11±0.01 0.83±0.05 9.67±0.50 0.14±0.01 2.43±0.02 15.95 j-3 0.40±0.02 0.53±0.04 0.11±0.00 0.08±0.00 0.93±0.07 0.40±0.02 0.11±0.01 0.65±0.05 8.89±0.34 0.12±0.00 2.56±0.03 14.80 j-4 0.43±0.00 0.88±0.01 0.26±0.00 0.12±0.01 0.66±0.01 0.31±0.00 0.41±0.01 0.57±0.00 8.06±0.23 0.17±0.01 1.19±0.09 13.08 j-5 0.40±0.02 0.68±0.00 0.20±0.02 0.08±0.00 0.68±0.00 0.29±0.00 0.26±0.00 0.49±0.01 7.75±0.21 0.14±0.00 1.05±0.02 12.01 j-6 0.45±0.01 0.64±0.04 0.19±0.01 0.09±0.01 1.13±0.05 0.19±0.01 0.13±0.01 0.76±0.01 8.68±0.26 0.14±0.00 1.04±0.02 13.44 j-7 0.47±0.01 0.43±0.01 0.12±0.01 0.07±0.02 1.38±0.04 0.32±0.00 0.08±0.00 0.63±0.01 7.37±0.09 0.11±0.00 0.97±0.01 11.96 j-8 0.55±0.01 0.82±0.02 0.21±0.00 0.09±0.09 1.29±0.02 0.21±0.01 0.09±0.00 1.01±0.01 12.25±0.07 0.16±0.00 1.05±0.01 17.75 j-9 0.56±0.04 0.64±0.02 0.18±0.00 0.08±0.00 0.75±0.01 0.23±0.01 0.08±0.00 0.72±0.05 10.00±0.35 0.13±0.00 1.02±0.01 14.39 j-10 0.50±0.01 0.65±0.03 0.19±0.00 0.11±0.00 1.32±0.00 0.33±0.01 0.10±0.00 0.77±0.02 9.85±0.24 0.14±0.00 1.00±0.02 14.97 j-11 0.47±0.01 0.48±0.01 0.13±0.00 0.10±0.00 1.32±0.05 0.17±0.00 0.08±0.00 0.68±0.03 7.24±0.24 0.13±0.00 0.97±0.02 11.77 j-12 0.47±0.01 0.63±0.02 0.18±0.01 0.09±0.00 0.95±0.02 0.15±0.01 0.12±0.00 0.68±0.01 7.40±0.15 0.13±0.00 1.03±0.02 11.82 j-13 0.37±0.01 0.69±0.01 0.15±0.00 0.10±0.00 1.03±0.01 0.16±0.00 0.19±0.01 0.65±0.01 8.29±0.10 0.16±0.00 1.02±0.00 12.81 j-14 0.60±0.02 0.69±0.01 0.17±0.00 0.11±0.00 0.73±0.03 0.18±0.01 0.12±0.00 0.36±0.00 8.31±0.06 0.18±0.00 0.34±0.01 11.79 s-1 0.29±0.04 1.00±0.06 0.25±0.00 0.20±0.00 0.84±0.06 0.35±0.04 0.36±0.01 0.73±0.03 10.71±0.35 0.17±0.01 0.09±0.00 14.97 s-2 0.24±0.00 0.54±0.03 0.12±0.01 0.06±0.01 1.26±0.04 0.55±0.03 0.12±0.01 0.75±0.02 9.8总量j-1 0.49±0.01 1.15±0.01 0.33±0.01 0.14±0.01 0.66±0.03 0.14±0.00 0.29±0.00 0.67±0.01 9.1 6±0.23 0.13±0.01 0.13±0.00 13.76

表4 酒当归及生当归样品指纹峰面积归一百分含量/%Tab.4 Percent content of characteristic peaks in different wine-baked Angelica and unprocessed Angelica by peak area normalization method/%

2.4.5.7 生当归与酒当归指纹图谱相似度分析

酒当归14份样品和生当归2份样品按上述方法导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)，酒当归与其对照谱的相似度为0.960±0.12(n=14)，生当归与其对照谱的相似度为0.990±0.02(n=2)，而酒当归与生当归的相似度为0.919，可以看出，酒当归样品与生当归存在差异，但差异较小。由图6，图7可知，11个指纹峰在14批样品的色谱图中均出现，各批供试品指纹图谱的重现性较好，但各批供试品间共有指纹峰的相对含量有一定差别，其中9号峰即藳本内酯相对含量最高，为最主要特征成分，相比较生当归其9号峰峰面积明显增加。且酒当归中检出峰数也有所增加。

3 讨论

3.1 采用中药饮片研究方法，对产于甘肃岷县、渭源、宕昌等道地产区的14批生当归炮制后的酒当归样品进行测定比较，通过对酒当归饮片的“性状鉴别”、“理化鉴别”、“检查”、“含量测定”等项目的系统研究。对各组研究数据资料进行系统分析，以此为基础可以制定酒当归饮片的名称、药材来源、饮片规格、显微鉴别、水分限量、总灰分限量、酸不溶性灰分限量、浸出物限量、有效成分含量下限等饮片质量标准，能够全面控制酒当归饮片质量。

3.2 酒当归饮片与生当归饮片相比其表面颜色较深，有淡淡的酒香味，木质层颜色较深，这是传统鉴别酒当归的主要依据。粉末显微鉴别试验中生当归和酒当归的显微结构发生了一定的变化如导管颜色加深，油室细胞被破坏从而减少，这是由于当归在受热和酒的作用下使得当归的细胞结构遭到破坏而发生了变化［3］。以薄层色谱测定的结果来看，薄层色谱展开系统分离效果好，斑点清晰，稍有拖尾，供试品与生当归对照品药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点。但实验中发现，不同产地的酒当归饮片斑点亮度不同，有些斑点不够清晰，说明14个产地的酒当归中成分含量有一定差异。

3.3 目前《中国药典》中，以阿魏酸成分作为指标来控制当归的质量或据此建立其质量标准，这不能很好的控制当归炮制品的质量，也不能完全代表当归的质量。长期以来中医界对此颇有意见，不同意用某某素或某某苷来代表某某药。中医临床用药的整体观点，它不仅是中医药几千年来的传统习惯，也是中医药区别于现代医药的重要方面之一［9］。采用的某一种或某几种有效成分的含量来作为中药质量评价标准的方法不够充分、客观，也难以为中医药理论所接受［10］。只要选择一个能代表某味药材的组分色谱峰，然后再选择其他各味药材代表峰，并对代表峰与标准峰比值作一限度范围，即可对所要检测中成药中每味药材做出一个较好的定性定量，以此来控制制剂的质量［11］。这在目前尚未弄清哪些有效成分之前，同时又缺乏相应的各种标准品之时，可保证中药的质量，这种方法是可信可行的。本试验针对酒当归中化学成分复杂，其与生当归化学成分相似，采用以阿魏酸单一对照品为基准对多指标成分定量分析方法，测定11个指纹峰的以阿魏酸计的相对含量，且对这11个峰所占比例进行分析，可以反映酒当归化学成分的基本情况，这样可以全面的控制酒当归饮片的质量，提高酒当归饮片质量控制水平，保证临床安全、合理用药。

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