涎腺干细胞在放射性口干症中的应用及研究进展

李志华 易 炜 牛道立

涎腺干细胞在放射性口干症中的应用及研究进展

李志华 易 炜 牛道立*

放射治疗是头颈部肿瘤的主要治疗方法之一，但有引起放射性口干症的可能。目前放射性口干症尚无较好的防治方法，近年来的研究发现，涎腺干细胞主要集中分布在涎腺较大的排泄管上，其可对放射后损伤的涎腺结构和功能起到修复作用，若能在放疗中有效保护涎腺干细胞，则有可能减轻口干症状。另外，应用涎腺干细胞移植技术修复受损的涎腺已在动物实验中得到验证。若能将涎腺干细胞科学有效地应用于临床，则有望改善病人放疗后口干症状，提高生活质量。

涎腺干细胞；放射性口干症；涎腺损伤；放射治疗；干细胞移植

头颈部肿瘤的主要治疗方法之一是放射治疗，通过放疗可取得较好的疗效，但与此同时，由于涎腺常与放疗靶区毗邻，其不可避免地会受到照射，分泌功能受到损伤，引起放射性口干症等并发症。唾液有自洁和抗菌作用，唾液分泌过少时可导致很多问题，如语言困难、吞咽困难、口腔灼烧感、味觉障碍、龋齿和牙周炎等，严重影响病人的生活质量[1]。近年来涎腺干细胞的研究取得一定进展，为防治放射性口干症提供了新的途径和思路。

1 涎腺的组织结构特点

涎腺（salivary gland）可分为大、小涎腺，其中大涎腺包括腮腺、颌下腺和舌下腺。各涎腺组织结构大同小异，都是由腺泡与导管组成，主要包括以下几种细胞：以分泌水和蛋白质为主要功能的腺泡细胞 （acinus cell）；调节唾液成分的导管细胞（duct cell）； 位于腺泡和导管周围的肌上皮细胞（myoepithelial cell）[2]。腺泡连接于导管末端，由分泌细胞、基底膜和肌上皮细胞组成。导管系统又分为闰管（intercalated duct）、分泌管（secretory duct）、排泄管（excretory duct）[3]。闰管直接与腺泡连接，再导入分泌管，闰管和分泌管位于腺小叶内，分泌管的下一级导管为排泄管，管径由细变粗，走行于小叶间结缔组织，最后汇入总导管，将分泌物排入口腔，混合形成唾液[2]。

2 放射性口干症的发生机制及防治现状

2.1 发生机制 腺泡是形成唾液的基本单位，放射治疗直接导致了腺泡细胞的死亡，引起唾液分泌的减少。涎腺腺泡细胞对放射线高度敏感，当涎腺组织受照剂量达到2 Gy时，急性反应将会在短期内出现，伴随大量的腺泡细胞死亡[4]；当累积放射剂量<25 Gy时，在1～2年内可观察到部分涎腺功能恢复；当累积放射剂量>30 Gy时，大部分受照射的涎腺组织发生放射性损伤，唾液分泌功能将长期低下，可见涎腺的受照剂量直接关系到其受损伤的程度[5]。涎腺放射损伤后早期，腺泡细胞即可发生变性、萎缩，出现细胞水肿、空泡化、线粒体内颗粒聚集与核固缩等现象，放射损伤后远期则表现为腺泡细胞萎缩、消失，导管扩张，间质纤维化，单核细胞及淋巴细胞浸润，脂肪组织增生等[6]。涎腺放射损伤后远期涎腺功能低下的主要原因是间质纤维化[3]。因此，当涎腺受到较高剂量的照射后，其腺泡细胞发生不可逆性损伤必然导致唾液分泌减少，故而出现放射性口干症。

2.2 防治现状 目前放射性口干症的防治方法主要有：放疗技术的改进、细胞保护剂的应用、颌下腺转位、促涎剂的应用、口腔湿润剂和人工唾液的应用等。但这些方法应用局限，疗效不确切，并不能有效地改善放疗后的口干症状，因此对于大量的头颈部肿瘤放疗病人迫切需要寻求一种有效防治放射性口干症的方法。

3 涎腺干细胞的发现及特点

干细胞具备自我更新能力和多向分化潜能。干细胞按来源可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）和成体干细胞（adult stem cell），前者来源于胚胎和胎儿组织，后者来源于出生后器官或成年个体组织[7]。 成体干细胞是个体出生后仍存在于已分化组织中的未分化细胞。组织在正常状态下，成体干细胞大多处于休眠状态，可有少量的成体干细胞进行自我更新、序贯分裂，维持足够的干细胞量[8]。当机体或组织遭受损伤或外因刺激时，成体干细胞可被某些因子活化，发生不对称分裂，即分裂得到的两个细胞，其中一个保持自我更新能力，而另一个则分化成为相应组织类型的细胞，修复损伤的组织，从而维持组织内环境的稳定[8]。

过去认为在成年个体中的高度分化组织已丧失了自我修复能力，但近年来国外研究显示涎腺组织中存在成体干细胞 （salivary gland adult stem cell，SGASC）[9-10]，说明成年个体的涎腺仍可能有自我修复潜能。Lombaert等[11]采用小鼠的下颌下腺组织，在体外用消化酶消化后进行细胞培养，发现培养物中的腺泡细胞在3 d后开始复制，导管样细胞也开始分裂、分化，同时用c-Kit、Sca-1和Musashi-1等干细胞标记物染色，发现导管细胞染色显示阳性，且这些干细胞样的细胞可在体外增殖，分化为有功能的腺泡细胞及导管细胞，该实验说明小鼠的下颌下腺中存在一种具备干细胞潜能的细胞。为了探究这种干细胞能否在放射受损的涎腺组织中起到修复作用，将雄性小鼠下颌下腺体外培养的c-Kit+干细胞注入已接受15 Gy/30 d放射的雌性小鼠的下颌下腺内，可观察到这些小鼠的下颌下腺在3个月后出现了大量的供体腺泡细胞增殖衍生，使受体小鼠下颌下腺的结构和功能在很长一段时间内得到恢复。试验说明小鼠下颌下腺中存在具有自我增殖和分化能力的干细胞，并能修复放射损伤的涎腺。更重要的是，从人的腮腺和下颌下腺提取的细胞同样含有c-Kit+干细胞，并且也能在体外培养中显示自我增殖和分化能力。Feng等[12]用类似的方式提取小鼠和人的腮腺及颌下腺细胞进行体外培养，也进一步证实了人和小鼠的涎腺一样含有干细胞群，其c-Kit标记阳性且具有自我增殖和分化的能力。Gorjup等[13]研究显示，涎腺导管上含有一种具有成体干细胞特性的细胞，具有高度的增殖和多向分化潜能，将其在体外培养并诱导可分化为腺泡细胞、导管细胞、脂肪细胞、肌上皮细胞、软骨细胞和成骨细胞等，这种具有成体干细胞特性的细胞位于腺泡和导管之间。

综合以上研究，在动物和人的涎腺中存在着具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，若能将这些干细胞科学有效地利用起来，将会对放射性口干症的防治提供新的途径和思路。

4 涎腺干细胞在修复涎腺放射损伤中的作用

在正常组织中，成体干细胞多处于相对静止状态，而当组织损伤或受外界刺激时，功能细胞损伤严重，就通过细胞增殖和干细胞分化来修复损伤，从而维持组织结构和功能的动态平衡[14]。放疗早期对组织的损伤势必会影响病人的生活质量，但放疗后很长一段时间里，存活的干细胞对组织结构和功能的修复起着重要的作用[15]。

Tatsuishi等[8]研究结果表明，放疗后涎腺组织损伤较轻时，仍可在临床样本中找到SGASC。正常组织中的成体干细胞处于G0期，放射耐受性较高，所以放射损伤后组织中存活的成体干细胞对组织的修复再生起着非常关键的作用[16]。Lombaert等[17]研究认为，放疗后唾液分泌减少的原因在于较高的照射剂量使涎腺干细胞数目减少，以致大量消亡的腺泡细胞得不到补充，唾液分泌受限，因此放疗后损伤涎腺的恢复程度与残留有活力的涎腺干细胞数目有关。为了验证这个观点，他们利用角质细胞生长因子（ΔN23－KGF）诱导干细胞增殖，将实验小鼠分为4组，即放射前4 d用ΔN23-KGF组、放射后4 d用ΔN23-KGF组、放射前后4 d都用ΔN23-KGF组和对照组。结果发现放射前4 d组和放射后4 d组的涎腺干细胞均明显增多，且存活的腺泡细胞也大量增加，涎腺功能得到改善，唾液流量增多；放射前后4 d都用ΔN23-KGF组的功能改善更明显，这可能是因为涎腺干细胞的扩增，使得涎腺组织得以修复，腺泡细胞得到补充，改善了涎腺功能，同时也验证了涎腺干细胞对放射损伤的涎腺有修复作用。

临床通过随访观察病人放疗后的唾液流率，发现病人的唾液分泌功能在慢慢恢复，可持续到放疗后5年依然得到改善[4]。这提示SGASC虽然处于相对静止状态，一旦涎腺遭受损伤，其干细胞的增殖与分化功能活跃，对涎腺组织损伤后期结构和功能的修复将起到非常重要的作用[18-19]。

5 涎腺干细胞的分布及放疗中的防护

Konings等[20]对大鼠腮腺分区照射进行了研究，将大鼠分为3组，分别照射100%腮腺组织、头侧50%腮腺组织、尾侧50%腮腺组织，予40 Gy单次剂量，于照射后1年观察这3组腮腺组织大体和显微镜下的改变以及腮腺功能。结果发现，100%腮腺组织受照的大鼠腮腺已明显萎缩并丧失分泌功能，头侧50%腮腺组织受照后其腮腺重量和分泌功能均比尾侧50%腮腺组织受照下降明显，且相比尾侧50%腮腺组织受照，头侧50%腮腺组织受照后1年其显微镜下的病理改变更严重，表明了腮腺放射后损伤程度与腮腺照射的区域有关。van Luijk等[18]发现，即使大鼠头侧50%的腮腺组织接受非常低剂量的照射，也可使尾侧腮腺组织的保护失去作用。研究显示了腮腺的放射损伤存在区域差异，这可能与腮腺干细胞在腮腺中呈不均匀性有关，也就是说，大鼠头侧腮腺组织可能含有更多的干细胞，这对腮腺的后期结构和功能的恢复起到关键作用。

van Luijk等[18]研究还显示，涎腺中对放射最敏感的是含有大量排泄管的部位，排泄管很可能就是涎腺干细胞的来源，而这些分布不均的涎腺干细胞可能决定了放疗后涎腺损伤的恢复程度和效果。当前已有较多关于涎腺干细胞在涎腺中分布的研究，其实验中利用c-Kit、Sca-1和Musashi-1等干细胞标志物标记及筛选涎腺干细胞，发现干细胞主要集中分布于腮腺及下颌下腺较大的排泄管上[4,12,18,21]。也就是说，SGASC在涎腺中的分布是不均匀的，且主要集中于涎腺较大的排泄管上。这提示在放疗中保护好涎腺较大的排泄管，即可能使SGASC得到较好的保护，有可能使放疗后损伤的涎腺组织和功能得到较好的修复。

适形调强放疗 （intensity modulated radiation therapy，IMRT）的优势是可调节三维空间内的剂量强度，应用IMRT技术可使三维空间上的剂量分布尽可能地适形于靶区，同时正常的组织免受高剂量的照射。因此，在制定放疗计划时可将SGASC集中分布的排泄管区域勾画标记，严格限制该区域的剂量，这样可使SGASC得到较好的保护，减轻其放射性损伤，为涎腺结构和功能的修复奠定基础，从而有可能改善放疗后的口干症状。

邵等[22]将鼻咽癌病人的腮腺分为前外侧区和后内侧区两部分进行勾画，并分别予以剂量限制，设计IMRT计划，结果发现采用分区勾画的方法能显著降低干细胞集中部位（腮腺前外侧区）的辐射剂量，同时不增加整个腺体的平均辐射剂量、不影响靶区的剂量覆盖率，充分显示了鼻咽癌IMRT计划中腮腺分区勾画保护腮腺干细胞的可行性。在第31届欧洲放射肿瘤学协会会议上有报道指出，在头颈部肿瘤放疗中对较大的排泄管区域进行特别的剂量限制，可使该区域降低50%的辐射剂量，同时不影响靶区的剂量覆盖率且不增加整个腺体的平均辐射剂量，以此可以更好地保护腮腺干细胞，使放疗后损伤的腮腺得以修复[23]。有研究者认为，若使用剂量分布更优的质子放疗技术，可使涎腺的排泄管主分支区域得到更好的保护，从而使放疗后涎腺得到良好的修复[24-25]。但有关在放疗中予以涎腺干细胞剂量限制的相关动物或人体实验尚未见公开报道，还有很多理论仍需完善，有待进行更深入的研究和探讨。

6 涎腺干细胞移植在放射性口干症中的应用

在放疗过程中尽可能保护SGASC以修复受放疗后损伤的涎腺组织固然是一个好方法，但在应用三维适形放疗 （3-dimensional conformal radiation therapy，3D-CRT）或者二维常规放疗的病人中，大部分涎腺组织还是会受到高剂量的照射，而不能像IMRT一样有效保护涎腺干细胞。另外，对于晚期肿瘤病人，由于肿瘤体积较大，照射范围广，即使应用IMRT也很难使涎腺的剂量控制在可接受的范围内。此类病人的涎腺干细胞绝大部分已经损伤，涎腺组织的修复十分困难，病人将面临永久性的口干症。

那么可否在放疗前将自体SGASC提取收集并培养，待放疗结束后再植入受损的腺体组织？近年来也有很多研究者在进行涎腺干细胞移植的研究，试图通过干细胞移植来修复及重建受损的涎腺。Lombaert等[11]提取出小鼠下颌下腺c-Kit标记阳性的干细胞，将其注入到放射损伤的下颌下腺内，使得小鼠的涎腺形态和功能得到长期的恢复，并且显示只要移植100个c-Kit+的细胞就足以在3个月后完全修复唾液腺的功能和形态。这项研究首次证明了应用SGASC移植技术修复放疗后损伤的涎腺是有可能的。Nanduri等[26]进行的实验中，取出大鼠的部分颌下腺组织消化培养，筛选出表达c-Kit、CD133、CD49f和CD24等干细胞标记阳性的细胞，通过免疫组化等相关技术发现这类细胞分布于颌下腺的排泄管上，而后在经放射损伤的大鼠下颌下腺内分别注入这类干细胞标记阳性的细胞。结果显示，这些大鼠的唾液量均有提高，其中以注入c-Kit+细胞和CD133+细胞的大鼠唾液量增加较明显。由此推测，若在放射损伤后的涎腺联合植入干细胞标记阳性的涎腺干细胞群，则有修复损伤涎腺的可能，唾液量也将会得到更明显的提高。Nanduri等[27]进一步验证了这一点，将c-Kit+细胞联合CD24和（或）CD49标记阳性的干细胞注入经单次15 Gy照射的大鼠下颌下腺内，结果显示干细胞移植不仅使大鼠的唾液分泌功能恢复，而且使其涎腺组织得以修复，并且维持长期的稳定。Neumann等[10]利用低温储藏技术储藏大鼠涎腺干细胞，3年后取出发现其依然保持稳定的特性及功能，这为涎腺干细胞自体移植提供了可能。

通过涎腺干细胞移植修复已受损的涎腺，这无疑是一种治疗放射性口干症的好方法，且应用成体干细胞，不存在类似胚胎干细胞的道德伦理问题。但该技术目前还停留在动物实验阶段，操作复杂。如何简便快捷地分离和获取自体涎腺干细胞，以及获取后的培养和储存、保持其生物学活性、移植后如何保证其增殖与分化，仍是需解决的问题。

7 小结与展望

上述的多项研究表明，人的涎腺中确实存在干细胞，并有增殖和分化为腺泡细胞和导管细胞的潜能，这一特性无疑为放射性口干症的防治提供了新的途径。若能在放疗中降低SGASC的受照剂量，减轻其损伤，放疗后的涎腺组织和功能将会得到较好的修复；而通过干细胞移植修复已受损的涎腺，也会使病人唾液分泌的恢复成为可能。涎腺干细胞在预防和治疗放射性口干症中有较好的应用前景，若能将这两种方法科学有效地应用于临床，有望改善病人放疗后的口干症状，提高病人的生活质量。目前涎腺干细胞在放射性口干症中的应用还处在研究探索阶段，有些理论尚未统一和完善，还需进行更多的基础及临床研究。

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（收稿2014-07-05）

Application of salivary gland stem cells in radioactive xerostomia

LI Zhihua,YI Wei,NIU Daoli.Department of Radiotherapy,The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510230,China

Radiation therapy is one of the main treatments of head and neck cancer,it may cause radioactive xerostomia and other complications.Currently there is no ideal approaches to prevent and treat radioactive xerostomia.In recent years,evidence has shown salivary gland stem cells mainly locate in the larger excretory ducts of salivary glands.The stem cells could repair the structure and function of salivary gland after radiation damage.Protect salivary gland stem cells effectively in radiotherapy may relieve symptoms of dry mouth.The application of salivary gland stem cell transplants to repair damaged salivary gland has been validated in animal experiments.If the salivary gland stem cells can be applied to clinical scientifically and effectively,it is expected to improve the symptoms of dry mouth after radiotherapy,and improve the quality of life.

Salivary gland stem cells;Radioactive xerostomia;Salivary gland damage;Radiation therapy;Stem cell transplant

10.3874/j.issn.1674-1897.2015.01.Z0105

510230广州，广州医科大学附属第一医院放疗科

牛道立，E-mail：daoliniu@163.com

*审校者